虞 煒 蔡善保

胃癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第4的惡性腫瘤，其病死率在癌癥相關(guān)死亡中排名第2[1]。盡管近些年在胃癌的綜合治療方面取得了一些進(jìn)展，但胃癌患者的預(yù)后仍較差，5年生存率低于25%[2]。此外，大多數(shù)患者在確診時(shí)已處于中晚期，這也是導(dǎo)致胃癌患者預(yù)后不良的重要因素[3]。人過(guò)氧化物氧化還原酶-1(peroxiredoxin-1，PRDX1)是過(guò)氧化物氧化還原酶蛋白(peroxiredoxin,PRDX)家族成員，其在對(duì)抗活性氧簇(reactive oxygen species , ROS)、抗氧化過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。PRDX1的活性可涉及細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡和增殖等生物過(guò)程，以及可參與多種人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展[4]。有研究表明，PRDX1可以在不同類(lèi)型的腫瘤中發(fā)揮不同的作用，如在乳腺癌[5]、骨肉瘤[6]中作為抑癌基因發(fā)揮作用，也可在胰腺癌[7]、結(jié)直腸癌[8]中作為促癌基因發(fā)揮作用。但目前為止，PRDX1與胃癌之間的關(guān)系尚未明確。本研究首先在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)胃癌和癌旁組織中PRDX1的表達(dá)情況，結(jié)合患者臨床病理資料和隨訪(fǎng)資料，評(píng)估PRDX1能否成為胃癌的早期診斷及預(yù)后評(píng)估的新型生物學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料收集 2018年5月份就診安徽省腫瘤醫(yī)院并首次確診的21例胃癌患者的術(shù)后胃癌與癌旁組織新鮮標(biāo)本；同時(shí)收集2012年1月至2013年12月在安徽省腫瘤醫(yī)院就診并首次確診為胃癌的105例患者術(shù)后臨床病理切片及病理學(xué)資料，涉及臨床病理的105例患者中有69例男性和36例女性，平均年齡為(68.02±23.71)歲。根據(jù)第七版國(guó)際抗癌聯(lián)盟的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)確定腫瘤的病理分期[9]，Ⅰ-Ⅱ期的66例，Ⅲ-Ⅳ期的39例，所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放療或化療。

1.2 實(shí)時(shí)熒光 定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)用Trizol從21例新鮮胃癌和癌旁組織中提取總RNA，使用cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Green定量PCR試劑盒(Bio-Rad)和C1000熱循環(huán)儀檢測(cè)PRDX1在組織中的mRNA表達(dá)水平。PCR引物序列如下：Human PRDX1，正向5’-CCACGGAGATCATTGCTTTCA-3’和反向5’-AGGTGTATTGACCCATGCTAGAT-3’。每個(gè)樣品一式三份進(jìn)行測(cè)試，以GAPDH表達(dá)作為內(nèi)參。cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒序列號(hào)：RR037A，購(gòu)于中國(guó)大連TaKaRa公司；SYBR Green定量PCR試劑盒序列號(hào)：1708880，購(gòu)于美國(guó)加州bio-rad公司。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法 將從新鮮的21例胃癌患者組織中提取的細(xì)胞在磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)中洗滌后，在4℃以RIPA緩沖液(20 mM HEPES，pH 7.5，150 mM NaCl，10%甘油，50 mM EDTA，1%Triton X-100)裂解30 min。然后收集全細(xì)胞提取物并在4℃ 12 000 r/min下離心15 min。之后，用移液槍除去上清液，使用Bradford法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。通過(guò)SDS-PAGE分離等量的裂解物蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。之后，用5%脫脂牛奶封閉膜并在4℃下以PRDX1一抗孵育過(guò)夜。第2天，將膜在二抗中孵育，最后通過(guò)電化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯像。

1.4 免疫組織化學(xué)和評(píng)分 對(duì)從病理科調(diào)取的105例胃癌和癌旁組織標(biāo)本的石蠟切片進(jìn)行PRDX1免疫組化分析。將胃癌和癌旁組織的蠟塊切片制成4 μm厚的石蠟切片，使用兩步法免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)抗原的表達(dá)情況。室溫下將石蠟切片脫蠟脫苯后，在過(guò)氧化氫溶液中放15 min以抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。用磷酸鹽緩沖液(3次×3 min)洗滌后，在檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中進(jìn)行抗原修復(fù)。再次用PBS(3次×3 min)洗滌后，在室溫下用PRDX1單克隆抗體(Abcam，Cambridge，MA，美國(guó))染色約2 h。然后，用PBS(3次×3 min)再次洗滌。在切片上滴加通用型二抗，后室溫孵育約15 min后，用磷酸鹽緩沖液再洗滌(3次×3 min)。最后，每個(gè)切片在室溫下用50 μL DAB顯色液處理約3～10 min，并用顯微鏡觀察，PBS洗滌后，再次以蘇木精復(fù)染。最后脫水，封片。

根據(jù)細(xì)胞的染色強(qiáng)度對(duì)每張切片進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)腫瘤細(xì)胞的染色比例評(píng)分為0(1%)、1(2%～25%)、2(26%～50%)、3(51%～75%)和4分(≥76%)。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分為0(無(wú)染色)、1(弱)、2(中等)和3分(強(qiáng))。最終表達(dá)的結(jié)果通過(guò)“染色比例百分比得分×強(qiáng)度得分”來(lái)確定，總分為12分，0～3分被認(rèn)為是低表達(dá)，4～12分被認(rèn)為是高表達(dá)。所有染色分值的確定由2位病理學(xué)專(zhuān)家評(píng)估。

2 結(jié)果

2.1 PRDX1在胃癌及癌旁組織中表達(dá)的比較 在胃癌組織中，qRT-PCR結(jié)果顯示PRDX1mRNA表達(dá)水平的ΔCT值高于癌旁組織[(5.62±0.42)比(2.16±0.42)，t=14.550、P<0.001]。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示PRDX1在胃癌組織中的蛋白表達(dá)水平也高于配對(duì)的癌旁組織。見(jiàn)圖1。同時(shí)，從調(diào)取的105例有隨訪(fǎng)信息和臨床病理學(xué)資料的病理切片免疫組化分析結(jié)果得出，在大部分胃癌組織中PRDX1蛋白高表達(dá)(62/105)。見(jiàn)圖2。

圖1 Western Blot檢測(cè)21例胃癌和癌旁組織中PRDX1蛋白表達(dá)水平

圖2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)PRDX1在胃癌(A)和癌旁組織(B)中的表達(dá)情況(免疫組化×10)

2.2 PRDX1蛋白的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系對(duì)比 胃癌的低未分化與高中分化，T3+T4與T1+T2浸潤(rùn)深度，有與無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，及TNM III-IV與Ⅰ～Ⅱ分期，前者PRDX1的蛋白表達(dá)水平偏高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3 PRDX1的蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)進(jìn)一步評(píng)估PRDX1的蛋白表達(dá)與患者總生存時(shí)間(overall survival, OS)及無(wú)病生存時(shí)間(disease-free survival, DFS)的關(guān)系。結(jié)果表明，PRDX1的蛋白高表達(dá)患者的總生存時(shí)間及無(wú)病生存時(shí)間均低于PRDX1的蛋白低表達(dá)的患者。見(jiàn)圖3。

表1 PRDX1在胃癌中的表達(dá)與胃癌患者的臨床參數(shù)之間的關(guān)系(例)

圖3 Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析105例胃癌患者的OS和DFS與PRDX1的蛋白表達(dá)情況的關(guān)系

2.4 早期胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素分析 將患者總生存時(shí)間、無(wú)病生存時(shí)間作為因變量，患者性別(男性=0，女性=1)、年齡(21～60歲=0，60～85歲=1)、腫瘤大小(0.3～5.0=0，5.1～9.0=1)、腫瘤分化程度(高中分化=0，低未分化=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無(wú)=0，有=1)、浸潤(rùn)深度(T1+T2=0，T3+T4=1)、TNM分期(I-II=0，III-IV=1)、PRDX1 的蛋白表達(dá)(高=0，低=1)作為自變量納入COX回歸分析，統(tǒng)計(jì)過(guò)程中篩選變量的方式是Forward: LR法，COX單因素分析顯示，腫瘤分化程度(OS：P=0.001，DFS：P=0.003)、浸潤(rùn)深度(OS：P=0.021，DFS：P=0.030)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(OS：P= 0.006，DFS：P=0.001)、TNM分期(OS：P<0.001，DFS：P<0.001)及PRDX1的蛋白表達(dá)(OS：P=0.014，DFS：P=0.006)與胃癌患者的總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間相關(guān)；COX多因素分析顯示，PRDX1的蛋白高表達(dá)(OS：P<0.001，DFS：P=0.017)、TNM分期(OS：P<0.001，DFS：P=0.004)為胃癌患者總生存時(shí)間和無(wú)病生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后影響因子。見(jiàn)表2、3。

表2 COX單因素和多因素分析患者臨床病理參數(shù)與總生存時(shí)間的相關(guān)性

表3 Cox單因素和多因素分析患者臨床病理參數(shù)與無(wú)病生存時(shí)間的相關(guān)性

3 討論

篩選胃癌診斷的分子標(biāo)志物并能明確其在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用乃至機(jī)制是極其重要的。因此，本課題組希望能尋找到胃癌的早期診斷標(biāo)志物，并能對(duì)預(yù)后判斷有一定的指導(dǎo)意義。

PRDX1是以抗氧化酶的作用被發(fā)現(xiàn)的，其對(duì)氧化應(yīng)激非常敏感，在應(yīng)激條件下可從過(guò)氧化物酶轉(zhuǎn)化為分子伴侶[10]。最近有研究[11]表明，PRDX1的表達(dá)與人類(lèi)腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。PRDX1基因位于1q34.1染色體上，而1q染色體的雜合性缺失已經(jīng)被證實(shí)參與腫瘤的進(jìn)展[12-13]。除了抗氧化物酶和分子伴侶功能，PRDX1還可增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒性，并抑制致癌蛋白，如c-Myc和c-Abl等的表達(dá)。PRDX1還可以通過(guò)結(jié)合磷酸酶及張力蛋白同源物基因( phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)促進(jìn)PTEN的腫瘤抑制作用，并保護(hù)其脂質(zhì)磷酸酶活性免受H2O2誘導(dǎo)失活[14]。實(shí)驗(yàn)[15]證明，缺乏PRDX1的小鼠會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的溶血性貧血和各種類(lèi)型的惡性腫瘤，這表明PRDX1可作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用。但迄今為止，PRDX1在胃癌中的表達(dá)及作用尚未被報(bào)道。

本研究了解到PRDX1在胃癌組織中的蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，且表達(dá)評(píng)分與患者的臨床病理特征具有明顯的相關(guān)性，PRDX1蛋白高表達(dá)患者胃癌細(xì)胞分化程度越低且病期越晚，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率越高。此外，生存分析顯示：PRDX1蛋白高表達(dá)患者的總生存時(shí)間及無(wú)病生存時(shí)間均顯著低于PRDX1蛋白低表達(dá)的患者。有研究[16]證明，PRDX1在大多數(shù)的腫瘤中高表達(dá)，并且PRDX1蛋白水平的高表達(dá)通常伴隨著較差的預(yù)后。有學(xué)者[17]報(bào)道，PRDX1在少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高甲基化，敲除PRDX1可顯著促進(jìn)細(xì)胞凋亡，降低Hs683膠質(zhì)瘤細(xì)胞受到放療或使用替莫唑胺化療的存活率。PRDX1還可以通過(guò)刺激絲裂原活化蛋白激酶5(mitogen-activated protein kinase-5，MKP-5)活性來(lái)避免活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的乳腺癌細(xì)胞的衰老[18]。Jiang等[19]報(bào)道，肺癌患者腫瘤組織中PRDX1的表達(dá)水平高，并且PRDX1的高表達(dá)可能與肺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分化程度有關(guān)，且在肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，血漿中PRDX1水平通常也較高，認(rèn)為可以將PRDX1作為肺癌的生物學(xué)標(biāo)志物。

綜上，筆者推測(cè)PRDX1可作為胃癌診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)志物。但就目前來(lái)看，PRDX1在胃癌中的病理生理作用尚未被揭示，接下來(lái)擬進(jìn)一步研究PRDX1在胃癌發(fā)生發(fā)展中的具體分子機(jī)制。