鄧 云 ，蘇 妍 ，應(yīng)薛養(yǎng) ，許 卿 ，連 珊 ，方 旭 ，吳娟娟

（1．福建省南平市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，福建南平354200；

2．建陽(yáng)市農(nóng)業(yè)局，福建南平354200；3．南平市種子管理站，福建南平354200）

稻瘟病菌屬于稻梨孢菌屬。由稻瘟病菌引起的稻瘟病是水稻的主要病害之一，每年由其造成的水稻損失可占水稻總產(chǎn)量的10%～30%，是阻礙水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一［1-2］。至今為止，稻瘟病遍及世界各大水稻主產(chǎn)區(qū)，其中以亞洲和非洲病情較為嚴(yán)重。福建省稻瘟病常年發(fā)生，嚴(yán)重危害水稻產(chǎn)量，一般情況下稻瘟病只在局部地區(qū)發(fā)生，如果品種感病，又逢有利于發(fā)病的氣候條件，稻瘟病則會(huì)大面積發(fā)生、流行，對(duì)水稻生產(chǎn)造成極大威脅［3］。

目前，對(duì)稻瘟病的防治主要是化學(xué)藥劑防治［4］。市場(chǎng)上防治稻瘟病的各類型各品牌殺菌劑種類繁多，由于耐藥性和殺菌劑質(zhì)量的影響使得這些殺菌劑對(duì)稻瘟病的防治效果參差不齊［5］。所以，在對(duì)稻瘟病進(jìn)行防治之前需要篩選效果好的殺菌劑，而篩選殺菌劑是一件費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作。殺菌劑篩選分為實(shí)驗(yàn)室篩選和田間篩選兩種，田間篩選主要是通過(guò)設(shè)置三重復(fù)小區(qū)，測(cè)試殺菌劑對(duì)稻瘟病田間發(fā)病的控制作用，相對(duì)實(shí)驗(yàn)室篩選耗費(fèi)人力、物力、財(cái)力較多，不適合大批量篩選殺菌劑，因此，常采用實(shí)驗(yàn)室篩選方法來(lái)對(duì)稻瘟病藥劑進(jìn)行大批量初篩選［6-7］?，F(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室篩選方法主要是采用菌絲生長(zhǎng)速率法，具體為：先制備長(zhǎng)滿稻瘟病菌的大片菌餅；同時(shí)配置含有殺菌劑的平板培養(yǎng)基；然后，用菌種打孔器在大片菌餅上打取小顆粒菌餅，并將小顆粒菌餅長(zhǎng)有菌絲的一面朝下放入含有殺菌劑的平板培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)；最后通過(guò)測(cè)量平板培養(yǎng)基上以小顆粒菌餅為中心的菌落的直徑大小來(lái)判斷殺菌劑的殺菌效果（菌落直徑越小，殺菌劑的殺菌效果越好）。但是，由于小顆粒菌餅的制作過(guò)程相對(duì)復(fù)雜，存在消毒不方便、操作過(guò)程繁瑣等問(wèn)題，效率低，不利于大批量快速篩選殺菌劑；并且，小顆粒菌餅僅一面長(zhǎng)有菌絲，其接種于平板培養(yǎng)基后小顆粒菌餅四周的菌絲長(zhǎng)勢(shì)不均勻，影響菌落直徑測(cè)量的準(zhǔn)確性。因此，亟待尋找一種利于大批量快速篩選稻瘟病殺菌劑的方法。本技術(shù)方法提供一種快速篩選藥劑的方法。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

大麥粒（用于培養(yǎng)稻瘟病菌絲）。

制作一個(gè)白底黑字的塑料圓形十字刻度板，直徑為9 cm（如圖1所示）放在平板培養(yǎng)基的正下方。

培養(yǎng)基為可溶性淀粉培養(yǎng)基，其成分為：可溶性淀粉10.0 g，酵母膏2.0 g，CaCO33.0 g，瓊脂粉16.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，pH 6.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大麥粒培養(yǎng)稻瘟病菌 35 g（約1 000粒）大麥泡水0.5 h后煮沸至半熟，承裝在250 mL的培養(yǎng)瓶中，高壓滅菌。將稻瘟病菌接菌到高壓滅菌過(guò)的大麥粒中，接菌后將培養(yǎng)瓶平放至培養(yǎng)箱內(nèi)25～28℃培養(yǎng)7～10 d，期間搖動(dòng)1次培養(yǎng)瓶，讓已長(zhǎng)出的稻瘟病菌絲均勻分布整個(gè)培養(yǎng)瓶，以便充分均勻生長(zhǎng)。培養(yǎng)大麥粒所用的培養(yǎng)瓶為250 mL的茄形培養(yǎng)瓶，側(cè)面為平面可以平放，有利于菌絲的橫向生長(zhǎng)。

1.2.2 含藥劑平板培養(yǎng)基的制備 稱取一定量的各殺菌劑有效成分，無(wú)菌水溶解，稀釋成5個(gè)系列濃度藥液，濃度分別為10.000、5.000、2.500、1.250、0.625μg/mL的藥液。準(zhǔn)確吸取藥液依次加入到融化的可溶性淀粉培養(yǎng)基中（直徑為9 cm的培養(yǎng)皿），充分搖勻，制備成含有所設(shè)計(jì)的藥劑濃度梯度的平板培養(yǎng)基。同時(shí)設(shè)置不含藥的平板作空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.2.3 十字交叉放置大麥粒 將攜帶稻瘟病菌的大麥粒放在離十字刻度板（圖1）的中心交叉圓點(diǎn)2～2.5 cm處，十字形對(duì)稱放置，每個(gè)培養(yǎng)皿放4粒大麥粒。大麥粒放置時(shí)為防止后續(xù)因移動(dòng)培養(yǎng)皿而造成大麥粒移動(dòng)，應(yīng)先在培養(yǎng)皿相對(duì)應(yīng)的位置用滅菌燒過(guò)的鑷子頭在瓊脂中點(diǎn)出小洞，后將長(zhǎng)有菌絲的大麥粒鑲嵌于其中，防止位移，封口膜封口培養(yǎng)皿邊緣防止污染。

1.2.4 接菌后將平板培養(yǎng)基置放入25～28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7～10 d后調(diào)查結(jié)果，菌絲抑制效果見(jiàn)圖2。

1.2.5 培養(yǎng)到預(yù)定時(shí)間后，取出培養(yǎng)皿測(cè)量大麥粒的菌落直徑，采用卡尺以十字交叉法測(cè)量每個(gè)大麥粒的2個(gè)直徑，每皿4個(gè)大麥粒一共測(cè)量8個(gè)數(shù)據(jù)，以其均數(shù)代表菌落大小。用以下公式計(jì)算各藥劑處理對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率：菌絲生長(zhǎng)抑制率（%）=（1-處理菌落直徑/對(duì)照菌絲生長(zhǎng)）×100%。

1.2.6 根據(jù)各藥劑濃度對(duì)數(shù)值及對(duì)應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)抑制率幾率值作回歸分析，利用DPS分析軟件計(jì)算出回歸方程，求出抑制孢子萌發(fā)的藥液濃度。

圖1 培養(yǎng)皿十字刻度板示范

圖2 菌絲抑制效果

2 討論

大麥粒放置在培養(yǎng)皿中相對(duì)于牛津杯的菌餅操作更加簡(jiǎn)單方便，一瓶茄形培養(yǎng)瓶既可培養(yǎng)千粒以上大麥粒，而菌餅培養(yǎng)上千個(gè)至少需要幾十個(gè)培養(yǎng)皿，耗時(shí)耗材，另外在接菌到培養(yǎng)基的過(guò)程中，大麥粒的操作也較之菌餅簡(jiǎn)單易行，同時(shí)也減少操作的污染。

大麥粒培養(yǎng)菌絲的優(yōu)點(diǎn)，大麥粒菌絲的生長(zhǎng)為立體三維的全方位生長(zhǎng)，生長(zhǎng)均勻，不同于菌餅生長(zhǎng)為單面生長(zhǎng)，接菌后大麥粒擴(kuò)展菌絲也會(huì)較菌餅擴(kuò)展的更加均勻。

塑料圓形十字刻度板底為白色，刻度為黑色，使用時(shí)將圓形刻度板放置于培養(yǎng)皿外側(cè)底部，此種操作方便不易造成污染，可透過(guò)培養(yǎng)基看到底部進(jìn)行操作。

綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)方案可大大提高稻瘟病殺菌劑篩選的效率，利于大批量快速篩選稻瘟病殺菌劑。