常文婧， 趙彥艷

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院臨床遺傳科，沈陽 110004

生物組織是由不同結(jié)構(gòu)和功能的細(xì)胞群組成的三維立體結(jié)構(gòu)，而組織的生物學(xué)性狀是由數(shù)量占大多數(shù)的細(xì)胞群決定的，這樣會忽視或掩蓋數(shù)量較少的細(xì)胞群的關(guān)鍵變化。實體腫瘤組織由實質(zhì)和間質(zhì)2個部分構(gòu)成，腫瘤實質(zhì)即為腫瘤細(xì)胞，是腫瘤的主要成分，具有組織來源特異性；腫瘤的間質(zhì)起到支持和營養(yǎng)腫瘤實質(zhì)的作用，構(gòu)成腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境。此外，手術(shù)切除的腫瘤組織還包括與腫瘤細(xì)胞具有同種組織來源、且表型相對正常的癌旁組織。為了明確腫瘤發(fā)病機(jī)制，發(fā)掘敏感且特異的腫瘤標(biāo)記物，有必要對離體腫瘤組織內(nèi)的實質(zhì)、間質(zhì)和癌旁組織進(jìn)行明確分類，因此，如何從成分復(fù)雜的組織中獲得單一的細(xì)胞群成為腫瘤研究亟待解決的問題[1]。

激光捕獲顯微切割(laser capture microdissection，LCM)技術(shù)是于20世紀(jì)90年代末由美國國立研究院開發(fā)，并由美國Arcturus公司商品化而發(fā)展起來的一門新技術(shù)。LCM技術(shù)可以在顯微鏡直視下從器官或組織中準(zhǔn)確獲取某種特定的細(xì)胞群或單個細(xì)胞，其出現(xiàn)使解決腫瘤異質(zhì)性這一難題成為可能。隨著多組學(xué)測序技術(shù)的發(fā)展，LCM技術(shù)作為同質(zhì)化樣本的重要獲取手段已成為腫瘤基礎(chǔ)研究中的支撐技術(shù)，在單細(xì)胞測序方面具有不可替代的地位。基于此，本文主要對LCM的原理、優(yōu)勢及其在腫瘤多組學(xué)研究中的應(yīng)用進(jìn)行綜述，并對其未來可能的發(fā)展方向進(jìn)行展望，以期為腫瘤的研究和治療提供新的思路。

1 LCM系統(tǒng)原理及優(yōu)勢

激光捕獲顯微切割，即在顯微鏡直視下利用激光獲取靶細(xì)胞。LCM技術(shù)可以精確地捕獲實驗所需的細(xì)胞或組織，是一種從異質(zhì)組織標(biāo)本中分離特定細(xì)胞群的最先進(jìn)的技術(shù)。顯微切割的發(fā)展經(jīng)歷了手動顯微切割、機(jī)械控制顯微切割、液壓控制顯微切割以及激光捕獲顯微切割。為了高效、精確地獲得純凈的靶細(xì)胞，1996年，美國國立衛(wèi)生研究院發(fā)明了LCM技術(shù)；1997年，美國Arcturus公司成功研發(fā)了LCM系統(tǒng)，并且實現(xiàn)了其商品化銷售；隨后，德國Zeiss公司、Leica公司的LCM產(chǎn)品也迅速發(fā)展，并在國際上推廣應(yīng)用；近年來，瑞士MMI公司也推出其CellCut LCM系統(tǒng)，并在市場占據(jù)一席之地[2-5]。目前，主流的激光捕獲顯微切割系統(tǒng)有四大品牌，即ABI ArcturusXT、MMI CellCut Plus、Zeiss PALM MicroBeam、Leica LMD6500和LMD7000，其主要區(qū)別見表1。

表1 常用LCM系統(tǒng)特點對比[2-5]Table 1 Comparison of characteristics of common LCM systems[2-5]

根據(jù)激光類型可將LCM分為2大類：紅外LCM(infrared LCM，IR LCM)和紫外LCM(ultraviolet LCM，UV LCM)[6]。各類LCM系統(tǒng)的組成大致包括顯微鏡(正置或倒置)、固態(tài)激光二極管、激光控制器、可固定玻片的載物臺和照相機(jī)等。LCM系統(tǒng)通?？蛇B接到個人計算機(jī)，由操作者在鏡下選取目標(biāo)區(qū)域，手動控制激光發(fā)射[7-9]。以Leica LMD7000為例，實驗者使用表面附有薄膜——聚萘二甲酸乙二醇酯(polyethylene naphthalate，PEN)膜的載玻片，將樣品制備成切片或涂片，在顯微鏡下選取實驗所需的細(xì)胞群，發(fā)射紫外激光使PEN膜邊緣融化，隨后目標(biāo)細(xì)胞在重力作用下掉落在事先安裝好的EP管的蓋中，完成收集。激光發(fā)射所產(chǎn)生的大部分能量被PEN膜吸收，組織達(dá)到的最高溫度約為90 ℃，且僅維持幾毫秒，避免了對其他生物大分子的損傷[8,10]。

以富集循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)為例，常用的方法包括密度梯度離心法、免疫磁珠法[11]、流式細(xì)胞術(shù)[12]以及微流體芯片[13]等。上述傳統(tǒng)方法主要依賴于細(xì)胞表面的免疫結(jié)合作用或者細(xì)胞本身的物理特性，易受到細(xì)胞群的種類、數(shù)量以及抗體的特異性等多種因素的影響。對于數(shù)量稀少的細(xì)胞群，傳統(tǒng)方法難以避免非目標(biāo)細(xì)胞的污染。細(xì)胞培養(yǎng)雖然可以解決細(xì)胞異質(zhì)性的問題，但是培養(yǎng)條件使細(xì)胞脫離了生物體內(nèi)環(huán)境，不能完全反映在體狀態(tài)。與以上方法相比，LCM技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢。①樣品來源廣泛。將樣本制成切片并進(jìn)行組化染色后即可利用LCM技術(shù)獲取目標(biāo)細(xì)胞，部分LCM系統(tǒng)還能夠切割活細(xì)胞用于培養(yǎng)[14-15]。②捕獲效率高，操作簡單。在顯微鏡直視下選取靶細(xì)胞，使用鼠標(biāo)在顯示屏上選擇要切割的范圍，并且可以看到切割軌跡，收集結(jié)果可靠。③能夠以高能量激光切割薄膜，避免接觸樣品帶來外界污染。激光發(fā)射所產(chǎn)生的能量可以瞬間融化薄膜并分離目標(biāo)細(xì)胞及其周圍組織，從而保證組織結(jié)構(gòu)的完整性，避免了傳統(tǒng)顯微操作時周圍組織碎屑的污染；同時，激光產(chǎn)生的熱量會被瞬時冷卻，不會破壞靶細(xì)胞內(nèi)的核酸與蛋白質(zhì)，這對于下游蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的分析極為重要。

近年來，隨著微量RNA提取、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification，WGA)[15]等分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，LCM結(jié)合二代測序(next-generation sequencing，NGS)、雙向凝膠電泳(dimensional gel electrophoresis，2-DE)、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)、實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)等技術(shù)在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)等領(lǐng)域展現(xiàn)出了巨大的潛力。

2 基于LCM的腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究

LCM能夠精確、便捷地實現(xiàn)組織的選擇和分離，同時保證樣品的純度，多應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析中的樣品制備環(huán)節(jié)。已有研究利用LCM技術(shù)對混合組織進(jìn)行分類獲取，聯(lián)合LC-MS/MS或qRT-PCR技術(shù)對樣本進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，驗證了組織異質(zhì)性問題[16-17]。腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)與LCM技術(shù)相結(jié)合可以鑒定良、惡性腫瘤中差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，篩選特異性的腫瘤分子標(biāo)記物，進(jìn)而明確致病機(jī)制或以此作為新的治療靶點[18]。

LC-MS/MS是蛋白質(zhì)組學(xué)最基本的分析手段，在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)分析中同樣被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的2-DE分離對蛋白質(zhì)的檢驗量有限，而同位素標(biāo)記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ)技術(shù)具有高通量、樣本類型無限制等優(yōu)點，在腫瘤蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用逐漸增多[19-21]。如Li等[20]使用LCM技術(shù)獲取肺腺癌組織和正常組織，再采用iTRAQ技術(shù)與2D-LC-MS/MS相結(jié)合的方式檢測出510個差異蛋白，其中35.5%為與線粒體相關(guān)蛋白。C1QBP為補體成分1q亞單位結(jié)合蛋白，定位于線粒體，是氧化磷酸化的關(guān)鍵分子，參與腫瘤代謝的調(diào)節(jié)。該研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中C1QBP表達(dá)明顯升高，且C1QBP的上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM病理分級及臨床分期有關(guān)。此外，通量更高的非標(biāo)記LC-MS/MS的使用也在不斷增加。Zhang等[22]分別利用LCM技術(shù)和酶解法(enzymatically isolated and cultured，EIC)從3例新鮮胰腺冰凍切片中獲取等量的胰島細(xì)胞和腺泡組織，結(jié)合非標(biāo)記LC-MS/MS，將LCM和EIC獲得的胰腺組織進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)譜比對，篩選出了百余種共同表達(dá)的蛋白質(zhì)以及幾十種具有不同功能的差異表達(dá)蛋白。對于胰腺等酶含量豐富的組織來說，LCM避免了EIC過程中的降解或污染，能夠如實反映組織或細(xì)胞的在體狀態(tài)。

LCM可以從極少量的樣本中將異質(zhì)性細(xì)胞進(jìn)行分類富集，適用于臨床樣品稀少的情況，但這也對下游蛋白質(zhì)譜檢測的靈敏度和分辨率提出了較高的要求。Palmer-Toy等[23]報道了一種基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)，該方法可直接分析經(jīng)LCM切割的樣本，且分辨率高、預(yù)處理時間短、所需樣本量少(約1 250個細(xì)胞)。Xu等[17]開發(fā)了一種集成化蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理技術(shù)(simple and integrated spintip-based proteomics technology，SISPROT)，并對LCM技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，將二者相結(jié)合，以面積為5 mm2、厚度為10 μm的結(jié)腸腫瘤病理切片為起始材料，建立了第1個包含腫瘤細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞4種重要結(jié)腸腫瘤細(xì)胞類型的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫。

3 基于LCM的腫瘤基因組學(xué)研究

基因組學(xué)研究同樣印證了廣泛存在的組織異質(zhì)性問題，如在泛發(fā)性萎縮性良性大皰性表皮松解癥患者中，由于突變的COL17A1基因發(fā)生二次改變，ⅩⅦ型膠原蛋白的部分再表達(dá)，表現(xiàn)出了嵌合性狀[24]。雜合性缺失(loss of heterozygosity，LOH)也是腫瘤組織異質(zhì)性的體現(xiàn)，LOH常用于研究腫瘤抑癌基因，定位染色體上的突變“熱點”，發(fā)現(xiàn)腫瘤早期的遺傳改變及其發(fā)生順序[25-26]。對于LOH的研究，首先要保證樣本的純度，LCM的應(yīng)用有效避免了非目標(biāo)細(xì)胞的混雜，使用微量樣品即可檢測，提高了LOH檢測的靈敏性和檢出率。Dias等[27]利用LCM技術(shù)分別從乳腺浸潤性導(dǎo)管癌、原位導(dǎo)管癌、正常乳腺小葉及淋巴結(jié)中分離出上皮細(xì)胞，對9號染色體短臂的5個微衛(wèi)星位點進(jìn)行LOH檢測，發(fā)現(xiàn)在浸潤性導(dǎo)管癌中LOH頻率最高，而且來源于同種組織的細(xì)胞存在LOH異質(zhì)性。除LOH分析外，還可利用LCM進(jìn)行其他基因組學(xué)分析，如LCM結(jié)合微陣列分析可被用于肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)基因組畸變的鑒定[28]。近年來，甲基化研究也逐漸成為腫瘤學(xué)熱點[29-30]，Pisanic等[29]利用LCM技術(shù)獲取高度惡性漿液性卵巢癌(high-grade serous ovarian carcinoma，HGSOC)組織及正常卵巢組織，結(jié)合定量甲基化特異性實時PCR(quantitative methylation-specific real-time PCR，qMSP)對HGSOC全基因組甲基化水平進(jìn)行分析，確定了一組高特異性的甲基化生物標(biāo)志物(c17orf64、IRX2、c6orf174、OTX2、LOC200726和NEUROD1)以用于腫瘤的早期篩查。

隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的發(fā)展，LCM逐漸成為單細(xì)胞研究的有力工具。2014年，Pascarella等[31]將LCM技術(shù)與納米基因表達(dá)帽分析(cap analysis of gene expression，CAGE)技術(shù)、NGS技術(shù)相結(jié)合，首次發(fā)現(xiàn)了在小鼠主嗅上皮(main olfactory epithelium，MOE)中，1型及2型梨鼻受體(vomeronasal type-1 receptors，V1Rs)、(vomeronasal type-2 receptors，V2Rs)存在轉(zhuǎn)錄活性，揭示了小鼠嗅覺功能單元間存在受體表達(dá)的交互作用。而Park等[32]利用LCM技術(shù)精確分離前列腺癌患者的單個CTC，結(jié)合單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)2例CTC單細(xì)胞的ATR、KMT2C、FANCC基因發(fā)生錯義突變，該發(fā)現(xiàn)揭示了腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制，對于研究腫瘤轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵CTC亞群具有重要意義?，F(xiàn)階段，LCM還被用于無創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)平臺的研發(fā)。NIPT主要有2種策略，一種是基于孕婦外周血中的胎兒游離DNA，另一種是基于胎兒有核紅細(xì)胞。后者所獲得的胎兒基因組信息相對完整，但因孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞過于稀有，難以獲得純凈樣本，因此基于胎兒有核紅細(xì)胞實現(xiàn)NIPT仍是一個國際難題。杜氏肌營養(yǎng)不良癥(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是由于抗肌萎縮蛋白基因(dystrophin，DMD)突變導(dǎo)致的全身肌肉呈漸進(jìn)性損傷和運動功能減退的X連鎖隱性遺傳病，DMD基因突變類型有多種，大片段缺失占60%～65%，大片段重復(fù)占5%～10%，點突變、小片段缺失和重復(fù)占25%～30%。本課題組最近通過制作孕婦外周血涂片，利用LCM技術(shù)精準(zhǔn)捕獲了血涂片中極稀有的胎兒有核紅細(xì)胞，經(jīng)單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增后，采用Sanger法對DMD基因完成了NIPT[33]。LCM作為一種最先進(jìn)的單細(xì)胞獲取工具，有望成為基于胎兒有核紅細(xì)胞的NIPT的支柱型技術(shù)。

4 基于LCM的腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究

LCM可以將腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞進(jìn)行快速分離而不會出現(xiàn)明顯的RNA降解，再結(jié)合下游RNA檢測方法以構(gòu)建腫瘤的全轉(zhuǎn)錄組及差異轉(zhuǎn)錄組信息。多個研究團(tuán)隊試圖從不同類型的LCM組織中摸索RNA回收的最佳條件[5,34-38]。目前已有多種RNA測序方法用于腫瘤全轉(zhuǎn)錄組分析，如qRT-PCR[39-41]、NGS[3,37-38,42]以及微陣列分析[35,43]，其中NGS在腫瘤轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析中應(yīng)用最為廣泛。

Civita等[37]使用LCM技術(shù)從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma，GBM)福爾馬林固定石蠟包埋(formalin fixed paraffin-embedded，F(xiàn)FPE)樣本的不同組織分區(qū)中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和血管內(nèi)皮細(xì)胞，經(jīng)NGS和數(shù)據(jù)分析篩選出8 585個差異表達(dá)基因，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)大部分差異表達(dá)基因與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、跨膜轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長等功能密切相關(guān)；GBM的異質(zhì)性還體現(xiàn)在其不同細(xì)胞群具有獨特的腫瘤微環(huán)境，如在壞死區(qū)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中，促進(jìn)血管生成和參與細(xì)胞遷移的基因過表達(dá)，這與此前報道的GBM可以促進(jìn)細(xì)胞浸潤生長、遷移、血管生成一致[37]。

此外，微陣列分析也是轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的常用手段。Roy等[35]利用LCM技術(shù)從完整皮膚和傷口邊緣活檢收集血管組織，利用微陣列分析建立兩者基因表達(dá)圖譜。在18 400個候選基因中，傷口部位血管中檢出了53個上調(diào)基因和24個下調(diào)基因，其中，新的腫瘤血管生成促進(jìn)因子——骨膜素(periostin，POSTN)在傷口邊緣血管中的表達(dá)是正常皮膚的96倍。該方法可以作為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的有力工具，對于多種生物學(xué)過程的分子機(jī)制研究具有重要意義。

對于LCM樣本的測序方法也在不斷改進(jìn)，從而使其在處理本身條件不佳的樣品時仍能有較高的可信度。最新報道稱Smart-3SEQ能夠保持較好的單細(xì)胞測序靈敏性和準(zhǔn)確性，通過單獨分離和測量每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，將組織學(xué)和分子病理學(xué)的差異細(xì)化至細(xì)胞水平[42]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)合LCM技術(shù)能夠精準(zhǔn)地反映細(xì)胞的“原位”信息，對于腫瘤生物學(xué)、病理學(xué)和生物標(biāo)志物鑒定等方面的研究具有重大作用。

5 展望

LCM技術(shù)與傳統(tǒng)的機(jī)械法和酶解法等樣品獲取方式相比具有強(qiáng)大的技術(shù)優(yōu)勢，在腫瘤的蛋白質(zhì)組學(xué)、基因組學(xué)以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大潛力，在探索腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制和篩查腫瘤標(biāo)志物的科學(xué)研究中得到極大地應(yīng)用。然而，針對LCM的特點，其仍有以下3個方面需要完善。①切片的制備方法對于LCM樣本質(zhì)量的影響較大，尤其是經(jīng)過固定的石蠟切片，可能對下游蛋白的分析造成較大影響[44]。因此，針對不同來源的組織，優(yōu)化處理條件、建立標(biāo)準(zhǔn)化處理方式十分必要。如利用傅里葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)成像技術(shù)對未經(jīng)組化染色的彌漫性惡性間皮瘤切片進(jìn)行識別和分型，精確度達(dá)到85%，避免了化學(xué)染色對組織的損傷以及觀察者的主觀效應(yīng)[45]。②LCM作為一種高精確度的樣本分離工具，能夠精確地從特定區(qū)域捕獲目標(biāo)細(xì)胞，其數(shù)量可以低至幾百個細(xì)胞甚至是單個細(xì)胞。而對于極微量細(xì)胞的處理和分析，則依賴下游高靈敏度和準(zhǔn)確度的處理方法。因此，提高微量樣本分析的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性才能使LCM技術(shù)真正用于臨床腫瘤學(xué)。目前LCM作為一種極其重要的單細(xì)胞樣本獲取工具，已經(jīng)在CTCs測序中發(fā)揮了重要作用，隨著現(xiàn)有單細(xì)胞分析技術(shù)的興盛和新技術(shù)的興起，如單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增[46]、單細(xì)胞測序[47-50]，研究人員對腫瘤的認(rèn)識將更加豐富與全面。③對LCM系統(tǒng)來說，蓋玻片會阻礙激光的作用，裸露的組織切片在顯微鏡下識別時，樣品折光率的改變可能會導(dǎo)致視野模糊，達(dá)不到理想的分辨率。對于稀有細(xì)胞的捕獲，如對腫瘤轉(zhuǎn)移具有重要作用的CTCs，鏡下人工尋找效率極低。當(dāng)前，自動識別是人工智能的重要研究方向，若將相應(yīng)的識別軟件搭載到LCM系統(tǒng)中，實現(xiàn)全自動取樣，對于腫瘤的診斷和治療具有指導(dǎo)意義。