胡柳 吳妍 韓銓

[摘要]目的 比較兩種不同慢性心肌缺血造模方式之間的差異及優(yōu)劣情況。方法 選取雄性ICR小鼠30只，根據(jù)造模方式的不同分為皮下注射組、緩釋泵釋放組、正常對照組，每組各10只。皮下注射組于小鼠腰背部皮下注射異丙腎上腺素（ISO）30 mg/（kg·d），連續(xù)注射14 d;緩釋泵釋放組于小鼠腰背部皮下埋入微量緩釋泵，ISO釋放量30 mg/（kg·d）;正常對照組小鼠皮下注射等劑量生理鹽水。采用心肌酶譜、心臟切片TTC染色等指標衡量小鼠的心肌缺血程度。結(jié)果 皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的造模死亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的心臟心肌肥大指數(shù)高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的心肌肥大指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌缺血面積百分比高于皮下注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌酶譜各項指標和肌鈣蛋白（cTnT）水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-羥丁酸脫氧酶（α-HBDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及同工酶（mAST）、cTnT水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脫氧酶（LDH）水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組與皮下注射組小鼠的心肌酶譜各項指標及cTnT水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 皮下注射及緩釋泵釋放ISO兩種方式均可以造成小鼠心肌肥大，緩釋泵釋放則能更大程度上誘導小鼠出現(xiàn)心肌缺血，緩釋泵釋放同時在更大程度上造成了心肌功能的損傷。

[關鍵詞]慢性心肌缺血;異丙腎上腺素;緩釋泵;皮下注射;小鼠

[中圖分類號] R541? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2020）2（b）-0007-05

[Abstract] Objective To compare the differences and advantages between different methods of chronic myocardial ischemia. Methods Thirty male ICR mice were selected and divided into subcutaneous injection group， sustained-release pump release group and control group according to different modeling methods， with 10 rats in each group. In the subcutaneous group， Isoproterenol （ISO） 30 mg/（kg·d） was injected subcutaneously into the lumbar back of the mice for 14 days. The release pump group was placed subcutaneously in the lumbar back of the mice. The ISO release amount was 30 mg/（kg·d）. The control group was injected subcutaneously with an equal dose of physiological saline. Myocardial ischemia was measured by myocardial zymogram and heart section TTC staining. Results There was no significant difference in the mortality between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The cardiac hypertrophy index of the mice in the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group was higher than that in the normal control group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. There was no significant difference in the cardiac hypertrophy index between the subcutaneous injection group and the sustained-release pump release group （P>0.05）. The myocardial ischemic area of the mice in the sustained-release pump release group was higher than that of the subcutaneous injection group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. The myocardial enzymes and cardiac troponin T （cTnT） level of the mice in the sustained-release pump release group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. The levels of α-hydroxybutyrate deoxygenase （α-HBDH）， aspartate aminotransferase （AST）， isozyme （mAST） and cTnT in the subcutaneous group were higher than those in the normal control group， and the differences were statistically significant （P<0.05）. While the levels of creatine kinase （CK） and isoenzyme （CK-MB） and lactate deoxygenase （LDH） in the subcutaneous group were not significantly different from those of the normal control group （P>0.05）. There was no significant difference in myocardial zymogram and cTnT between the sustained-release pump release group and the subcutaneous injection group （P>0.05）. Conclusion Both subcutaneous injection and sustained release pump release ISO can cause myocardial hypertrophy in mice， sustained release pump can induce myocardial ischemia in mice to a greater extent， and sustained release pump also causes damage to myocardial function to a greater extent.

[Key words] Chronic myocardial ischemia; Isoproterenol; Sustained release pump; Percutaneous injection; Mice

心血管疾病是我國導致居民死亡的第一病因，而且患病率仍將持續(xù)增加[1]，因此，研究心血管疾病的病因和發(fā)病機制對于提高人民的健康水平、延長壽命具有重大意義[2]。心肌缺血（myocardial ischemia）是指由于心臟出現(xiàn)生理或病理性的血液灌注減少，從而導致心臟相應的供氧減少，最終引起心肌能量代謝異常，不能維持心臟正常工作狀態(tài)的一種病理狀態(tài)。

心血管疾病的康復機制研究的關鍵技術之一是復制心肌缺血動物模型。建立適當?shù)膭游锬Ｐ?，不僅為該病的發(fā)病機制和病理生理改變提供重要的資料，更重要的是能夠促進新藥的開發(fā)，推進臨床診斷的各種治療方法的進步。據(jù)文獻報道，皮下注射大劑量異丙腎上腺素（Isoproterenol，ISO）會導致大小鼠急性心肌缺血損傷[3-7]，這種損傷與人的急性心肌缺血較為相似， 故可作為評價藥物抗心肌缺血的動物模型[8]。ISO的作用機制為興奮β1受體，使心肌興奮性提高、收縮加快、心率加快、代謝旺盛，增加心肌耗氧量，從而造成心臟負荷過重，同時興奮β2受體，使外周血管擴張，回心血量減少，動脈壓降低，冠脈流量減少。

實驗研究過程中，實驗動物模型應在滿足與疾病相似性、重復性、可靠性等前提下，盡可能模擬人類心肌缺血疾病的發(fā)生、發(fā)展狀態(tài)，可以為探求心肌缺血疾病的病因、發(fā)病機制、臨床治療提供更好的研究基礎。目前，現(xiàn)有的心肌缺血的模型大致可以分為以下幾類：急性心肌缺血模型、慢性心肌缺血模型、可控性心肌缺血模型和離體心肌缺血模型。本研究的主要目的，是比較皮下注射和皮下緩釋泵釋放兩種給藥方式下，哪種慢性心肌缺血模型的造模方式更穩(wěn)定，小鼠存活率更高，心肌缺血狀態(tài)更明顯，從而為今后對于冠心病的研究提供可靠的動物模型。

1對象與方法

1.1 實驗動物

本研究實驗所用動物為ICR小鼠，共30只，雄性，18～22 g，SPF級，均購于浙江省醫(yī)學科學院實驗動物中心，實驗動物合格證號：SCXK（浙）2019-0002。小鼠均自由攝食和飲水，適應性飼養(yǎng)1周左右后，開始實驗操作。

1.2主要儀器與試劑

1.2.1實驗試劑

ISO注射液（上海禾豐制藥有限公司，生產(chǎn)批號：6E20003，規(guī)格：0.5 mg/ml）;生理鹽水（江蘇長江藥業(yè)有限公司，批準文號：國A20070002）;水合氯醛（中國醫(yī)藥集團上海化學試劑公司，生產(chǎn)批號：20120720）。

1.2.2實驗儀器

微量緩釋泵（Alzet，model 1002），0.22 μm濾膜，1 ml注射器，剃毛刀，手術器械。

1.3實驗分組及處理

1.3.1動物分組

將30只雄性ICR小鼠隨機分為三組，每組各10只。正常對照組小鼠皮下注射生理鹽水，10 μl/g，連續(xù)注射14 d;皮下注射組小鼠皮下注射ISO，給藥量為30 mg/（kg·d）[9]，10 μl/g，連續(xù)注射14 d;緩釋泵釋放組小鼠皮下植入含有ISO的緩釋泵，給藥量為30 mg/（kg·d），6 μl/d，連續(xù)注射14 d，緩釋泵內(nèi)ISO濃度=小鼠重量×30 mg/（kg·d）×14 d/（1000×6 μl/d×14 d）。

1.3.2緩釋泵的制備

1.3.2.1配制ISO溶液? 使用劑量為30 mg/（kg·d），所用ISO溶液的濃度為100 mg/ml（預計小鼠重量為20 g）。①稱取200 mg ISO，加入2 ml的生理鹽水溶液，充分溶解;②0.22 μm濾膜過濾ISO溶液;③無菌條件下取出緩釋泵，放在干凈的紗布上，注意不要污染;④稱量記錄空泵重量，一般約為0.5 g，取出注射裝置，安裝上注射管，吸取約0.2 ml的ISO溶液，左手垂直手持緩釋泵，右手持注射管，垂直插到管底，緩慢推注射器，并緩慢上提注射器，直至有液體流出，擦拭掉流出的液體，并安裝上pump的頭部插件;⑤再次稱量記錄注入ISO后緩釋泵的重量，兩次相差應該大于90 mg，否則吸出ISO再次灌注緩釋泵;⑥將緩釋泵置入無菌的0.9%生理鹽水中，37℃孵箱中過夜（>6 h）。

1.3.2.2緩釋泵的植入? ①配制4%水合氯醛，麻醉小鼠，以0.2 ml/20 g劑量進行腹腔注射;②小鼠背部脫毛，酒精消毒后，于兩塊肩胛骨中間，與體軸呈90°剪開一個小口子，使用鑷子沿著口子在小鼠背部掏一個口袋，用來放緩釋泵;③將泵放入口袋中，縫合背部，并涂上青霉素鈉，將小鼠放在保溫墊上待完全蘇醒后，放回籠中。

1.4觀察指標及檢測方法

1.4.1觀察指標

在給藥14 d后，①摘取小鼠眼球，取全血和血清，比較三組小鼠心肌酶譜及肌鈣蛋白（cTnT）水平，心肌酶譜指標包括α-羥丁酸脫氫酶（α-HBDH）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及同工酶（mAST）、肌酸激酶（CK）及同工酶（CK-MB）、乳酸脫氧酶（LDH）;②測量小鼠的體重及心臟重量，并記錄，使用心肌肥大指數(shù)（HW/BW）作為衡量心臟肥大的指標[10];③心臟組織切片進行心肌缺血TTC染色;④統(tǒng)計小鼠死亡率。

1.4.2 TTC染色

小鼠處死后取心臟，刀片垂直心臟長軸將其橫切為5～6片，每片約為2 mm。展平后置于1% TTC溶液中，37℃避光孵育20 min后置于10%中性甲醛（0.1 mol/L PBS配制）中。于染色后第1周對4個橫切片的正反兩面進行圖像采集，照片采用Photoshop 3S Extended軟件計算心肌缺血面積。心肌缺血面積百分比（%）=心肌缺血面積/橫切片總面積×100%[11]。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠造模死亡率的比較

給藥14 d后，皮下注射組小鼠存活8只，死亡2只，死亡率為20%;而緩釋泵釋放組小鼠存活10只，無死亡，死亡率為0%。皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的造模死亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2.222，P=0.136）。

2.2三組小鼠心臟肥大及心肌缺血情況的比較

皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的HW/BW高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組小鼠的HW/BW比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;緩釋泵釋放組小鼠的心肌缺血面積百分比高于皮下注射組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）（表1、圖1）。

2.3三組小鼠心肌酶譜及cTnT水平的比較

緩釋泵釋放組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組的心肌酶譜各項指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。緩釋泵釋放組與皮下注射組小鼠的cTnT水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組與緩釋泵釋放組的cTnT水平比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）（表2）。

3討論

心血管疾病現(xiàn)如今已成為威脅人類生命健康的最主要的疾病之一，而心肌缺血性疾病又是在心血管疾病總發(fā)病率中占比較高的一類疾病。心血管疾病的相關基礎研究的難點之一就是建立合適可重復的心肌缺血動物模型。建立適當?shù)膭游锬Ｐ?，不僅能為該病的發(fā)病機制和病理生理改變的研究奠定基礎，更重要的是能推動新藥的開發(fā)，促進臨床診斷和各種治療方法的進步。在已有文獻報道的心肌缺血模型中，動物種類和造模方法較多，應用不同動物建立的心肌缺血模型具有不同特點，因此建議根據(jù)研究實驗的要求選擇適當?shù)膭游锖驮炷７椒╗12]。

ISO是一種非特異性β-腎上腺素受體激動劑，在小鼠心肌缺血、心臟肥大等病理模型中應用廣泛[6]。有文獻報道顯示，皮下注射大劑量ISO會導致大小鼠急性心肌缺血損傷[6-7]，這種損傷的病理變化與人的急性心肌缺血病理過程較為相似，因此可以應用其來進行心肌缺血動物模型的藥效評價。且有研究顯示，在小鼠腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO劑量分別為0.3、3、30 mg/（kg·d），2周后均可以誘導出心肌缺血及心臟肥大[13]。另有學者報道稱，于小鼠背部皮下注射ISO 5 mg/（kg·d），持續(xù)1周[14]，或者腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO 5 mg/（kg·d），持續(xù)2周[15]，也均可引起明顯的心臟肥大和心肌缺血癥狀。

在前期實驗中，筆者已經(jīng)探索到腹腔注射ISO無法穩(wěn)定成模，實驗動物在實驗中期即會呈現(xiàn)較高的死亡率。且相關研究顯示，小鼠皮下注射ISO有一定可能性會出現(xiàn)皮下硬結(jié)，呈現(xiàn)不同程度的發(fā)硬和黑痂，并且會隨著造模天數(shù)的增加，逐漸加重，最終可能影響藥物吸收，無法達到有效的造模劑量，導致造模失敗[16-18]。另一方面，雖然腹腔注射吸收快，但極有可能因為血液內(nèi)藥物濃度迅速達到高峰，導致藥物單次劑量過大而造成實驗動物死亡率增加[18-19]。因此，在本研究中，引入了ALzet微量緩釋泵，與皮下注射ISO的造模方法進行比較。本研究結(jié)果顯示，采用腰部皮下包埋微量緩釋泵釋放ISO 30 mg/（kg·d）或腰背部皮下注射ISO 30 mg/（kg·d）2周均可以成功誘導小鼠出現(xiàn)顯著的心肌肥大和心肌缺血癥狀，這一結(jié)果與相關研究報道一致[13]。且微量緩釋泵造模得到的心肌缺血狀態(tài)更為嚴重。

心肌中通常存在多種心肌酶，其中包括AST、LDH及同功酶、α-HBDH和CK及CK-MB，通常將這一組與心肌損傷相關的酶合稱為心肌酶譜，對心肌梗死具有重要的診斷意義[20]。LDH、CK、AST及mAST在維持心肌正常生理功能方面發(fā)揮著重要的作用。存在于組織中的LDH其活力比存在于血清中的LDH高得多，所以當出現(xiàn)組織壞死時，該酶即從組織中釋放入血，而使血清中的酶活力升高。在正常情況下，AST存在于組織細胞內(nèi)，其中心肌細胞中含量最高，血清中含量極少。當心肌細胞由于缺血而受到損傷時，細胞內(nèi)的AST釋放入血，使血清AST含量升高，臨床一般也將其視為心肌梗死的輔助檢查指標[20]。當心肌發(fā)生缺血或梗塞時，心肌受損，導致心肌細胞內(nèi)的心肌酶釋放入血，血液中酶活性增高，進一步造成心肌的損傷?！阏J為，血清中AST、CK、LDH含量升高程度與心肌梗死程度成正相關，因此血清中LDH、AST、CK及其同工酶的活性可作為衡量心肌缺血程度的指標[20]。

本研究結(jié)果顯示，緩釋泵釋放組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST、CK及CK-MB、LDH水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清α-HBDH、AST、mAST水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;皮下注射組小鼠的血清CK、CK-MB、LDH水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。提示兩組均在一定程度上造成了心肌功能的損傷，而皮下注射組對于小鼠心肌功能的損傷程度低于緩釋泵釋放組。

cTnT作為心肌細胞所特有的一種調(diào)鈣蛋白，具有較高的心肌特異性，是反映心肌壞死的血清標志物，對評價心肌細胞損傷同樣具有重要意義。cTnT 存在于心肌細胞的細肌絲中，是心肌肌鈣蛋白復合體中的一種多肽亞單位，具有高度的心肌特異性，當缺血缺氧造成心肌細胞損傷時，細胞膜通透性增加，大量cTnT釋放入血，使血清中cTnT濃度迅速升高[20]。cTnT具有入血時間早、濃度高、持續(xù)時間長等特點，對于不同程度的心肌缺血具有較高的靈敏度及特異性，在監(jiān)測心肌梗死的發(fā)展、治療及預后上具有重要意義。cTnT相比較于經(jīng)典的酶學指標CK-MB具有更高的敏感性，并且診斷窗口期更寬，因此，近年來cTnT成為了心肌缺血早期和晚期診斷的重要實驗室指標。

本研究中使用的兩種造模方法具有不同的特點，皮下注射ISO相較于其他造模方法，不需要手術開腹、開胸，對實驗動物損傷小，死亡率低于腹腔注射的造模方法[21]; Alzet微量緩釋泵造價較高，且無法重復利用，應用該方法單次實驗成本會相應提高。但微量緩釋泵給藥過程穩(wěn)定且只需一次操作，相較于一般的手術造模方法對實驗動物傷害較小，人為操作失誤而引起的系統(tǒng)誤差小，小鼠存活率高，得到的心肌缺血模型穩(wěn)定且可重復。綜上所述，本研究認為于ICR小鼠腰背部皮下包埋微量緩釋泵，給予ISO 30 mg/（kg·d）2周，可以建立穩(wěn)定顯著的心肌肥大和心肌缺血模型，該方法操作簡單，且能保證實驗動物較高的存活率，但造價相對較高。為進一步心血管疾病的研究提供了模型參考，值得推廣。

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（收稿日期：2019-07-25? 本文編輯：閆? 佩）