王丹華，陳盼盼*，王宏亮

1. 臺(tái)州職業(yè)技術(shù)學(xué)院（臺(tái)州 318000）；2. 臨海市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心（臺(tái)州 317000）

民以食為天，食以安為先。隨著我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)的不斷發(fā)展，老百姓的餐桌不斷豐富的同時(shí)，食品安全問題日益成為老百姓關(guān)注的焦點(diǎn)。蝦，是老百姓非常喜愛的一類水產(chǎn)品，現(xiàn)階段隨著蝦養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，據(jù)調(diào)查少部分不法養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖蝦的過程中，使用雌二醇、己烯雌酚等雌激素，用以提高蝦的養(yǎng)殖速度和產(chǎn)量。雌二醇等雌激素是一類有廣泛生物活性的類固醇化合物，具有促進(jìn)和維持女性生殖器官和第二性征的生理作用，并對內(nèi)分泌系統(tǒng)、肌體的代謝和骨骼的生成和成熟有影響[1-4]；近年來，不斷有調(diào)查發(fā)現(xiàn)大量水生生物出現(xiàn)性別畸形，如雌性貝類長出來了雄性器官、雄性虹鱒魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)有卵黃蛋白等，因此加強(qiáng)對養(yǎng)殖蝦中的雌激素監(jiān)測，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

養(yǎng)殖水產(chǎn)品中雌激素的檢測方法主要有液相色譜法、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法和液相色譜-質(zhì)譜法[5-13]。液相色譜法及氣相色譜法專屬性偏差，易出現(xiàn)假陽性的結(jié)果；液相色譜-質(zhì)譜法檢測雌二醇等低沸點(diǎn)的雌激素，靈敏度差；相比較而言，氣相色譜-質(zhì)譜法更適用于雌二醇、己烯雌酚等低沸點(diǎn)的雌激素，且氣相色譜-質(zhì)譜法檢測成本更低，適于該方法的推廣使用。加速溶劑萃取（ASE）的方法是一種在提高溫度和壓力的條件下，用有機(jī)溶劑萃取的自動(dòng)化方法[14-15]。該方法有機(jī)溶劑用量少、快速、基質(zhì)影響小等優(yōu)點(diǎn)，已在食品、藥品、環(huán)境等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。試驗(yàn)建立一種利用加速溶劑萃取法提取養(yǎng)殖蝦中的雌二醇等雌激素，氣相色譜-質(zhì)譜法進(jìn)行定性定量分析的方法。結(jié)果表明，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 儀器部分

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（型號2010plus-TQ 8040，日本島津）；色譜柱Rtx-5 MS（日本島津）；氮?dú)獯蹈蓛x（MTN型，北京華瑞博遠(yuǎn)）；電子天平（XS204型，0.1 mg，瑞士梅特勒）；純水器（Milli-Q，美國Milli Pore）；加速溶劑萃取儀（Dionex ASE 350型，美國Thermo Fisher）。

高速冷凍離心機(jī)（FRESCO17型，熱電（中國））；氮吹儀（N-EVAP-24型，美國Organomation公司）；恒溫干燥箱（FED115型，德國Binder）。

1.2 試劑部分

雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99%，德國Dr. Ehrenstorfor公司）；甲醇、乙腈、乙酸乙酯（色譜純，德國merck試劑公司）；純化水（自制）；弗羅里硅土（分析純，上海國藥）；衍生化試劑：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）、三甲基硅烷，美國Sigma公司。

1.3 色譜參數(shù)

氣相色譜：進(jìn)樣口溫度250 ℃；毛細(xì)管色譜柱：Rtx-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣：高純氦氣（純度≥99.999%）；氦氣流量：1.5 mL/min；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量：1 μL。色譜柱溫度：50 ℃保持1 min；20 ℃/min升溫至160 ℃，15 ℃/min升溫至280 ℃，保持8 min。

質(zhì)譜：離子源，電子轟擊源（EI）；電離能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；溶劑延遲時(shí)間：2 min；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。

1.4 樣品溶液配制

樣品預(yù)處理：取養(yǎng)殖蝦的可食用部分，充分勻漿后置于樣品盒中冷凍保存，備用。

樣品提?。悍Q取5 g（精確至0.01 g）已預(yù)處理的樣品，加入5 g弗羅里硅土，與樣品充分混勻，用體積比1︰1的乙腈-乙酸乙酯混合溶劑作為提取溶劑，在加速溶劑萃取儀中萃取。萃取條件：提取溫度85 ℃，壓力10.0 MPa，靜態(tài)提取時(shí)間6 min，提取次數(shù)3次，淋洗體積60%，氮?dú)獯祾?0 s。

向吹干的殘?jiān)屑尤?00 μL衍生化試劑，蓋緊具塞試管并渦旋1 min，置于60 ℃烘箱中反應(yīng)60 min，取出后冷卻至室溫，進(jìn)樣氣相色譜-質(zhì)譜測試。

1.5 溶液配制

衍生化試劑：N-甲基三甲基硅基三氟乙酰胺（NSTFA）-三甲基硅烷（99︰1，V/V）。1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液

準(zhǔn)確稱取雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，各0.1 g（精確至0.001 g），分別置于100 mL量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得1 mg/mL的各單標(biāo)儲(chǔ)備液；將儲(chǔ)備液置于-18 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，保質(zhì)期6個(gè)月。

1.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液

精密量取1 mg/mL雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇儲(chǔ)備溶液，各1 mL，置于100 mL量瓶中，得到100 μg/mL混標(biāo)液。移取一定量體積的混標(biāo)液，配制含各雌激素質(zhì)量濃度為0.01，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0 μg/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇定容至刻度，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 萃取條件的優(yōu)化

萃取溫度對萃取結(jié)果至關(guān)重要。試驗(yàn)考察了70，80，90，100和110 ℃ 5個(gè)不同溫度對雌激素殘留效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度由70 ℃升至90 ℃時(shí)，各雌激素提取結(jié)果增加顯著；當(dāng)繼續(xù)升溫至110 ℃時(shí)，萃取結(jié)果基本恒定，因此選擇90 ℃作為最佳提取溫度。

2.2 洗脫溶劑選擇

洗脫溶劑的選擇至關(guān)重要，它直接影響樣品的凈化效果和分析物結(jié)果的準(zhǔn)確度。洗脫溶劑必須要對此次試驗(yàn)的5種雌激素具有較好的洗脫能力。水產(chǎn)品中雌激素的分析常用的洗脫溶劑主要有甲醇、乙腈、乙酸乙酯。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇作為洗脫溶劑時(shí)，雌激素的靈敏度較低；當(dāng)乙腈作為洗脫溶劑時(shí)，萃取效果好，回收率高，但是去除蝦中的脂肪效果差，干擾物較多；乙酸乙酯洗脫，能有效地去除脂肪，且5種雌激素的回收率較高。乙腈和乙酸乙酯合用既有效去除脂肪，又能到較高的回收率。因此，選擇體積比1︰1的乙腈-乙酸乙酯作為萃取雌激素的萃取溶劑。

2.3 質(zhì)譜條件的選擇

首先對5種雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）標(biāo)準(zhǔn)樣液以Q3SCAN模式全掃描，以確定5種雌激素的保留時(shí)間，并找出各自的產(chǎn)物離子；在MRM模式下對產(chǎn)物離子進(jìn)行碎片離子掃描，得到對應(yīng)的碎片離子。選擇響應(yīng)值高的1個(gè)離子作為定量離子，另選3對離子作定性離子。選擇好定量及定性離子后，對MRM方法進(jìn)行轟擊電壓、離子比率等質(zhì)譜條件的優(yōu)化，確保目標(biāo)峰靈敏度達(dá)到最佳。1對定量離子對、3對定性離子對結(jié)合保留時(shí)間，排除了假陽性樣品的存在，確保5種雌激素檢測結(jié)果準(zhǔn)確。5種雌激素離子對及質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)選擇如表1所示。

表1 5種雌激素殘留離子相關(guān)信息

圖1 5種雌激素標(biāo)準(zhǔn)譜圖

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

吸取一定量1.5.2項(xiàng)下配制的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液至2 mL去活的樣品反應(yīng)瓶中，氮?dú)獯抵两桑尤?00 μL衍生化試劑，按照1.4衍生化方法衍生操作。按1.3色譜質(zhì)譜條件上機(jī)進(jìn)樣。以各雌激素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以信號噪聲的比值（S/N=3）計(jì)算各激素的檢出限。標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限結(jié)果見表2。

由表2可以看出，5種獸藥激素在0.01～1.0 μg/mL線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，且靈敏度高，農(nóng)藥檢出限均在0.09～0.14 μ g/kg范圍內(nèi)。

表2 5種環(huán)境雌激素標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)與精密度測試

取不含待檢5種雌激素的養(yǎng)殖蝦空白樣品，在標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍內(nèi)加入低（1 μg/kg）、中（5 μg/kg）、高加標(biāo)量（10 μg/kg）三個(gè)不同濃度水平的雌激素混合標(biāo)樣，按照1.4方法處理樣品，考察加標(biāo)回收結(jié)果。每個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品平行進(jìn)樣6次，考察精密度6次測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差?；厥章逝c精密度檢測結(jié)果詳見表3?？梢钥闯觯?種雌激素3個(gè)濃度點(diǎn)的加標(biāo)回收率在80.6%～93.9%之間，進(jìn)樣6次方法精密度RSD在1.67%～4.72%之間。

表3 6種環(huán)境雌激素加標(biāo)回收率

2.6 實(shí)際樣品的測定

抽取30份市場售賣的養(yǎng)殖蝦（對蝦、小白蝦等），運(yùn)用試驗(yàn)所建立的方法對5種雌激素殘留進(jìn)行檢測。結(jié)果未發(fā)現(xiàn)5種雌激素的檢出；說明本地養(yǎng)殖蝦基地?zé)o雌激素添加的情況出現(xiàn)。

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了一種加速溶劑萃取-氣相色譜質(zhì)譜法檢測養(yǎng)殖蝦中5種雌激素（雌二醇、己烯雌酚、雌酮、炔雌醇、雌三醇）殘留的方法。該方法采取加速溶劑萃取儀對養(yǎng)殖蝦樣品進(jìn)行提取、凈化，選擇乙腈-乙酸乙酯（體積比1︰1）作為提取溶劑，采用衍生化方法進(jìn)樣氣相色譜質(zhì)譜對5種雌激素進(jìn)行檢測。試驗(yàn)對萃取條件進(jìn)行了優(yōu)化、對洗脫溶劑的選擇使用進(jìn)行了分析討論；對質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化；考察了方法的線性曲線及檢出限、準(zhǔn)確性（加標(biāo)回收）與精密度等，并對實(shí)際樣品進(jìn)行了測試。結(jié)果表明，該方法具有前處理簡單、靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)，可用于養(yǎng)殖蝦中該5種雌激素的監(jiān)測。