陸歡，徐寧*，王小艷，王春暉，彭運(yùn)祥，夏姣

1. 湖南省食用菌研究所（長沙 410013）；2. 漣源市食品藥品監(jiān)督管理局（婁底 417199）

食用菌采收后剩余的廢棄培養(yǎng)料稱為菌糠，與原始培養(yǎng)料相比，其粗纖維含量大幅度降低，粗蛋白含量顯著提高，且富含多種微量元素。近年來，我國食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，2017年全國食用菌總產(chǎn)量為3 712萬 t，杏鮑菇159.71萬 t，菌糠年生產(chǎn)量在2×108t以上。這些菌糠除少部分被循環(huán)利用為食用菌培養(yǎng)料外，往往被丟棄或燃燒，不但造成資源浪費(fèi)，同時(shí)還導(dǎo)致霉菌和害蟲的滋生，污染環(huán)境。目前，食用菌菌糠的資源化利用已受到廣泛關(guān)注，已報(bào)道的利用途徑不下10種[1-13]，但大多數(shù)研究還不夠深入，未在生產(chǎn)實(shí)踐中得到廣泛推廣。

水溶肥料是指能夠完全溶于水的多元素復(fù)合型、速效性肥料，可以完全溶解于水中，能被作物的根系和葉面直接吸收利用，可水肥同施，以水帶肥。近年來，水溶肥料產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速，與傳統(tǒng)的復(fù)合肥等相比，有效吸收率高，肥效快，可解決高產(chǎn)作物快速生長期的營養(yǎng)需求。近年來，氨基酸作為小分子有機(jī)物質(zhì)，不僅能促進(jìn)植物生長發(fā)育、增強(qiáng)抗逆性、改善土壤狀況、提高作物產(chǎn)量和改善品質(zhì)，還能減輕植物重金屬離子毒害、鈍化病原菌毒素等[14-16]，具有很好的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)效應(yīng)。

腐熟后的菌糠采用酶法結(jié)合微波提取法制備氨基酸水溶肥，是在利用菌糠生產(chǎn)肥料的基礎(chǔ)上，通過酶解過程釋放出更多的游離氨基酸和營養(yǎng)物質(zhì)。氨基酸水溶肥是一種高效安全肥料，菌糠為氨基酸的生產(chǎn)來源提供了很好的資源，而不再局限于皮革、毛發(fā)這類原料。因此，氨基酸肥料的研究和應(yīng)用，是目前肥料發(fā)展的重要方向，此次研究為菌糠制備氨基酸水溶肥開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杏鮑菇菌糠（產(chǎn)地湖南），曬干粉碎后，腐熟發(fā)酵備用。

風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

D 101大孔樹脂（天津）；電子天平；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；H 1850 R離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司）；HWS-26恒溫水浴鍋（蘇州江東州精密儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 游離氨基酸提取方法

稱取50 g腐熟菌糠，按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸餾水，充分浸泡3 h，分離出浸液，取濾渣按照料液比1︰20（g/mL）加入蒸餾水，充分浸泡3 h。2次浸泡處理水的溫度均保持為70 ℃，每間隔10 min進(jìn)行攪拌，并在攪拌后進(jìn)行微波處理3 min。冷卻后加酶控溫40 ℃反應(yīng)5 h，然后升溫至90 ℃滅酶活20 min。以12 000 r/min離心5 min，過濾，收集濾液，過大孔樹脂除去色素，濾液按濃縮比1︰10（g/mL）通過回旋蒸發(fā)儀濃縮濾液。冷卻后加入無水乙醇進(jìn)行醇沉，過夜，離心后取上清液，用茚三酮比色法測游離氨基酸。

1.3.2 酶種類及復(fù)合比例篩選

酶種類篩選：選擇風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶進(jìn)行單酶和復(fù)合酶的配比，酶添加總量為0.5%，以可溶性固形物和游離氨基酸為指標(biāo)，選擇提取效果最好的單酶或復(fù)合酶進(jìn)行復(fù)合酶比例的篩選。

1.3.3 酶反應(yīng)條件優(yōu)化

確定復(fù)合酶用量后，對反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行優(yōu)化。以游離氨基酸為指標(biāo)篩選最佳反應(yīng)條件，試驗(yàn)安排見表1。

表1 酶反應(yīng)條件

1.3.4 減壓蒸餾工藝優(yōu)化

濾液濃縮選擇蒸餾時(shí)間、蒸餾溫度為自變量，以固形物為參考指標(biāo)，平行取樣重復(fù)3次，取平均值。以濾液為原料，蒸餾溫度120 ℃，選擇在蒸餾時(shí)間10，20，30，40，50和60 min下進(jìn)行蒸餾；蒸餾時(shí)間30 min，選擇在蒸餾溫度100，110，120，130和140℃下進(jìn)行蒸餾。

根據(jù)蒸餾時(shí)間、蒸餾溫度單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)均勻試驗(yàn)，以固形物為參考指標(biāo)，觀察各組合濃縮效果，因素水平表見表2。

表2 均勻試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類對氨基酸含量的影響

采用風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶分別對腐熟菌糠進(jìn)行氨基酸提取，結(jié)果見表3。在單酶作用下，添加風(fēng)味酶進(jìn)行提取，可溶性固形物含量最高，添加木瓜蛋白酶提取，游離氨基酸含量最高。將3種酶中的任意2種分別按1︰1比例復(fù)合后進(jìn)行提取試驗(yàn)，結(jié)果顯示，風(fēng)味酶與木瓜蛋白酶復(fù)合有利于提高氨基酸含量，木瓜蛋白酶和纖維素酶復(fù)合有利于提高可溶性固形物。將3種酶按1︰1︰1比例復(fù)合進(jìn)行提取，結(jié)果不僅有利于提高氨基酸含量，還有利于增加可溶性固形物。將風(fēng)味酶和木瓜蛋白酶以1︰1（1指添加量為0.25%）的比例作為一個(gè)整體，在與纖維素酶進(jìn)行不同比例復(fù)合，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，3種酶其余比例相較于比例為1︰1︰1，添加量為0.5%時(shí)的氨基酸增加量并不明顯，但酶添加量增多，成本加大。因此，生產(chǎn)時(shí)選擇復(fù)合酶添加比例為1︰1︰1，總添加量為0.5%更為合適。

表3 不同酶對游離氨基酸提取效果的影響

2.2 酶反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

對表1中4種反應(yīng)條件下得到的提取液中游離氨基酸進(jìn)行分析，結(jié)果見表4。提取條件1，即提加酶后40℃反應(yīng)2 h，再提高至50 ℃反應(yīng)2 h，氨基酸含量較高；取條件2，即加酶后50 ℃反應(yīng)4 h，上清液中游離氨基酸含量最高，可見50 ℃酶反應(yīng)有利于氨基酸釋放；提取條件4，即不加酶50 ℃提取4 h，氨基酸含量最低。因此，加酶50 ℃反應(yīng)4 h有利于氨基酸的提取。

2.3 減壓蒸餾工藝優(yōu)化

2.3.1 蒸餾時(shí)間對游離氨基酸含量的影響

蒸餾時(shí)間對提取液濃縮后游離氨基酸含量的影響比較明顯。由表5可知，在10～30 min范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的增加，游離氨基酸釋放量增大。在30 min以后，隨著時(shí)間繼續(xù)延長，蒸餾時(shí)間對氨基酸釋放量影響不顯著，氨基酸含量沒有顯著差異，原因可能是后期因水分已被大量蒸發(fā)，多糖等含量增加導(dǎo)致稠度加大，不利于氨基酸釋放，因此蒸餾時(shí)間宜設(shè)定為20～40 min。

表5 蒸餾時(shí)間對游離氨基酸含量的影響

2.3.2 蒸餾溫度對游離氨基酸含量的影響

蒸餾溫度對提取液濃縮后游離氨基酸含量影響比較復(fù)雜，不同溫度對游離氨基酸釋放量有完全不同的影響。由表6可知，在10～120 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，游離氨基酸含量增大。在120 ℃以后，隨著溫度升高，游離氨基酸含量增加不顯著。原因可能是溫度增加破壞了濃縮液中所含物質(zhì)的結(jié)構(gòu)活性，影響氨基酸釋放量。

表6 蒸餾溫度對游離氨基酸含量的影響

2.3.3 減壓蒸餾均勻試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，以蒸餾溫度、蒸餾時(shí)間2個(gè)因素，選取因素水平進(jìn)行均勻試驗(yàn)，結(jié)果見表7。組號(hào)5的氨基酸含量最高，通過3組平行試驗(yàn)驗(yàn)證，氨基酸含量分別為13.57，13.62和13.70 g/L。由驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知：適宜水平組合為A2B2，即最適條件選取為蒸餾時(shí)間30 min、蒸餾溫度120 ℃。

表7 均勻試驗(yàn)方案與結(jié)果

3 結(jié)論與討論

菌糠制作有機(jī)肥的研究較少，且對氨基酸水溶肥的制備研究少有報(bào)道，而菌糠富含豐富的營養(yǎng)成分，值得綜合開發(fā)利用。試驗(yàn)對復(fù)合酶+微波法提取腐熟菌糠中的游離氨基酸進(jìn)行了研究。結(jié)果表明0.5%復(fù)合酶（風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶以1︰1︰1的比例復(fù)合）提取后效果最好，提取得到的游離氨基酸含量達(dá)到14.89 g/L。酶反應(yīng)條件優(yōu)化研究結(jié)果表明，加酶后先50 ℃反應(yīng)4 h效果最佳，分析原因可能是酶提一段時(shí)間后，游離氨基酸溶出速率穩(wěn)定，繼續(xù)升溫酶反應(yīng)對于其游離氨基酸含量增加影響不大。結(jié)合酶種類（風(fēng)味酶、木瓜蛋白酶和纖維素酶以1︰1︰1的比例復(fù)合），得到的游離氨基酸含量為13.02 g/L。減壓蒸餾通過單因素試驗(yàn)的結(jié)果得出，蒸餾時(shí)間的范圍宜設(shè)定為20～40 min，蒸餾溫度的范圍宜設(shè)定為100～120℃。由均勻試驗(yàn)結(jié)果分析可得到最優(yōu)組合，再通過驗(yàn)證試驗(yàn)綜合分析可知，適宜水平組合為A2B2，即蒸餾時(shí)間30 min，蒸餾溫度120 ℃，得到的游離氨基酸含量為13.64 g/L。試驗(yàn)為菌糠制備水溶肥提供了參考，具有一定的指導(dǎo)意義。