王 剛， 李 娟， 黃世光

(1中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科， 廣東 中山 528404； 2暨南大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632)

慢性根尖周病是由來自感染根管的感染刺激引起的宿主免疫反應(yīng)，在根尖周病損組織中存在的各種炎癥細(xì)胞、細(xì)胞因子和趨化因子可導(dǎo)致根尖周膠原纖維破壞，形成持續(xù)的炎癥并伴隨骨質(zhì)的破壞吸收。研究顯示，在人根尖周的病變組織中存在著大量的淋巴細(xì)胞(lymphocytes, LYMs)、中性粒細(xì)胞(neutrophil granulocytes)、巨噬細(xì)胞(macrophages, M?)和漿細(xì)胞(plasma cells)等，另外可見成纖維細(xì)胞(fibroblasts, FBs)增生，新生的毛細(xì)血管常襯以腫脹的內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells, ECs)[1]。白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)存在膜結(jié)合CD14(membrane-bound CD14, mCD14)和可溶性CD14(soluble CD14, sCD14)2種形式，mCD14主要表達(dá)于活化的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成熟單核細(xì)胞以及人牙齦成纖維細(xì)胞中[2]。白細(xì)胞介素4(interleukin-4, IL-4)是由Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，能刺激活化B細(xì)胞和T細(xì)胞增殖、 CD4+T細(xì)胞分化成II型輔助T細(xì)胞，在調(diào)節(jié)體液免疫和適應(yīng)性免疫中起關(guān)鍵作用。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)及IL-4參與了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控過程[3-4]。IL-4是一種多功能細(xì)胞因子，可抑制T淋巴細(xì)胞功能以及單核/巨噬細(xì)胞的活化和效應(yīng)作用，抑制Th1細(xì)胞因子，從而發(fā)揮抑炎作用, 促進(jìn)根尖周組織的修復(fù)和局限炎癥的免疫應(yīng)答機(jī)制[3]。TNF-α主要是由活化的巨噬細(xì)胞分泌，中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及肥大細(xì)胞也可分泌TNF-α，并且對其免疫功能作出調(diào)節(jié)，在根尖周病變中起著骨破壞的作用[4-5]。根尖周病變的發(fā)病及修復(fù)機(jī)制非常復(fù)雜，目前，尚未見人慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞表達(dá)的報道。因此，本實驗采用免疫熒光雙染色法，觀察TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞在不同類型慢性根尖周病組織中的表達(dá)情況，并探討TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞在慢性根尖周炎發(fā)病機(jī)制中的作用。

材 料 和 方 法

1 主要材料和儀器

Mouse Anti-CD14(Santa Cruz)；Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4(Abcam)；山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour?555(Cell Signaling Technology)；山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour?488(Cell Signaling Technology)；4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; MP Biomedicals)；DAB顯色試劑盒(ZLI-9019, 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。激光共聚焦顯微鏡(ZEISS)。

2 方法

2.1病例選擇 選擇2015年10月～2017年6月在中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院口腔分院牙體牙髓病科并自愿接受本研究的病例，其中男性45例，年齡(38.0±12.5)歲，女性43例，年齡(34.0±14.5)歲,其中43例為臨床診斷為根尖囊腫或慢性根尖周膿腫，接受根尖手術(shù)治療或無法保留的病例，慢性根尖周膿腫23例，根尖周囊腫為20例。對照組為因正畸需要拔除的前磨牙及健康無冠周炎的第三磨牙，病例數(shù)為45例[年齡(32.0±18.4)歲]?；颊吣挲g及性別均無顯著差異(P>0.05)。收集患者病歷時，各組男女比例和年齡層，在兩個層次上無統(tǒng)計學(xué)差異。所有選取女性病例均否認(rèn)懷孕、服用長效或短效避孕藥病史；所有患者排除心血管或其他系統(tǒng)性疾病，并且至少3個月內(nèi)未服用抗生素治療。所有患者均需要簽署知情同意書。

2.2實驗分組 實驗分為：(1)正常對照(healthy control)組(45例)：因正畸治療需要拔除的牙周健康的前磨牙或沒有冠周炎的智齒牙周膜組織，X線示根尖影像無明顯異常，根尖孔發(fā)育完成，牙周膜影像光滑連續(xù)，無增寬;(2)慢性根尖周膿腫(chronic periapical abscess)組(23例)：因根管治療效果不佳而行根尖刮治術(shù)或根尖切除術(shù)的刮除的根尖肉芽組織，或因牙槽骨吸收破壞嚴(yán)重導(dǎo)致無法保留需要拔除的患牙根尖肉芽組織，X線示根尖區(qū)典型的大片云霧狀透射陰影;(3)根尖周囊腫(periapical cyst)組(20例)：X 線片顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區(qū)，直徑>1 cm，邊界清楚有骨白線包繞，手術(shù)過程中觀察到根尖區(qū)病變組織為內(nèi)含液體或半固體的囊性組織。

2.3組織標(biāo)本采集和處理 根尖周組織標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定液中浸泡24～48 h，制作5 μm厚度的連續(xù)切片，行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各組的組織學(xué)變化。

2.4TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞免疫熒光雙染色 Ⅰ抗為Mouse Anti-CD14、Rabbit Anti-TNF-α和Rabbit Anti-IL-4，稀釋度為1∶100；Ⅱ抗為山羊抗鼠IgG(H+L) Alex Flour? 555和山羊抗兔IgG(H+L)Alex Flour? 488，稀釋度為1∶200。組織切片經(jīng)檸檬酸液修復(fù)，Ⅱ抗血清封閉，Ⅰ抗孵育，避光條件下Ⅱ抗孵育熒光染色，DAPI核染后，熒光顯微鏡觀察。TNF-α和IL-4陽性信號為紅色熒光， CD14免疫熒光陽性信號顯現(xiàn)為綠色熒光，定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞漿，同一視野下紅色熒光與綠色熒光重疊后為橘黃色熒光；細(xì)胞核顯現(xiàn)為藍(lán)色熒光。組織切片由2名病理醫(yī)師于熒光顯微鏡下盲法觀察，參照李娟等[6]的計數(shù)方法，選取10個代表性連續(xù)視野(0.072 5 mm2/視野)，對DAPI陽性及表達(dá)TNF-α-CD14或IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，獲得雙陽性細(xì)胞的密度(cells/mm2)，取平均值[7-8]。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)形式表示，采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0分析處理。各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14和IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞平均密度的比較采用完全隨機(jī)設(shè)計的單因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗。若方差齊時，多個樣本均數(shù)間每兩個均數(shù)的比較選用Bonferroni法；方差不齊時選用Tamhane’s T2法[6]。以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組HE染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織結(jié)果顯示，正常對照組牙周膜組織主要由纖維構(gòu)成，組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)基本完好；慢性根尖周膿腫組可見炎性肉芽組織，毛細(xì)血管和成纖維細(xì)胞增生，中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，部分病變內(nèi)部見上皮條索及上皮島；根尖周囊腫組可見大塊囊性結(jié)構(gòu)組織，炎性肉芽包饒中央壞死崩解結(jié)構(gòu)，纖維組織層以膠原纖維為主，肉芽組織細(xì)胞間水腫，囊壁上皮層下大量慢性炎癥細(xì)胞浸潤，含典型的鐵血黃素和膽固醇晶體，見圖1。

Figure 1.Histological changes of human periapical tissues (HE staining, the scale bar=50 μm). A: healthy control group; B: chronic periapical abscess group; C: fibrous layer of periapical cyst group; D: epithelium layer of periapical cyst group.

圖1 各組樣本HE染色結(jié)果

2 TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果顯示，正常對照組僅見少量散在分布的TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞；根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞數(shù)量比正常對照組明顯增加；慢性根尖周膿腫組中可見大量浸潤的TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞，見圖2～4。

3 IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

各組標(biāo)本組織中IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果顯示，正常對照組僅見少量散在分布的IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞；慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞數(shù)量比正常對照組明顯增加；根尖周囊腫組中可見大量浸潤的IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞，見圖5～7。

Figure 2.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖2 健康對照組TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 3.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖3 慢性根尖周膿腫組TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

4 TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞密度的比較結(jié)果

各組標(biāo)本組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞密度比較，結(jié)果顯示：(1)2組慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞密度較正常對照組顯著升高(P<0.05)；(2)慢性根尖膿腫組TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞密度較根尖周囊腫組顯著升高(P<0.05)；(3)根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞密度較慢性根尖膿腫組顯著升高(P<0.05),見圖8、9。

Figure 4.TNF-α-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: TNF-α+; C: DAPI+; D: merged.

圖4 根尖周囊腫組TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 5.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of healthy control group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖5 健康對照組IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

討 論

慢性根尖周炎的主要病理特征是炎癥細(xì)胞的浸潤及牙槽骨的吸收破壞[9]。促炎和抗炎細(xì)胞因子參與了根尖周疾病的介導(dǎo)及調(diào)控，炎癥性骨吸收是由根尖周組織中的炎癥或免疫細(xì)胞及其分泌的各種不同細(xì)胞因子所致，是免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子以及其它炎性介質(zhì)相互之間高度復(fù)雜共同作用的結(jié)果[10-11]。成骨與破骨的動態(tài)平衡是根尖周骨重建過程中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)[12]。

Figure 6.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of chronic periapical abscess group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖6 慢性根尖周膿腫組IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

Figure 7.IL-4-CD14 double-positive cell staining results of periapical cyst group (the scale bar=50 μm). A: CD14+; B: IL-4+; C: DAPI+; D: merged.

圖7 根尖周囊腫組IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞雙染色結(jié)果

在本研究中，我們采集了慢性根尖周膿腫和根尖周囊腫的標(biāo)本，以正常牙周膜組織作為對照。通過HE染色觀察比較各組標(biāo)本根尖周的組織學(xué)改變及炎癥細(xì)胞浸潤狀態(tài)。最近的研究結(jié)果表明，Th1和Th2細(xì)胞因子在慢性根尖周炎的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用。Th1免疫應(yīng)答參與了根尖周病變和骨質(zhì)破壞的進(jìn)展，而Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥免疫機(jī)制在病變發(fā)展晚期發(fā)生的愈合過程中發(fā)揮重要作用[13-14]。然而，調(diào)節(jié)這些免疫炎癥通路的機(jī)制尚未完全闡明。de Carvalho Fraga 等[15]觀察到在根尖周囊腫中IFN-γ蛋白水平升高，而根尖肉芽腫中的IL-4表達(dá)更強(qiáng)。Ribeiro 等[12]通過檢測根尖周囊腫中M2巨噬細(xì)胞和促炎細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)，評價Th1和Th2反應(yīng)在根尖周囊腫中的作用。結(jié)果提示M2巨噬細(xì)胞參與根尖周囊腫的炎癥反應(yīng)，同時存在促炎的Th1相關(guān)細(xì)胞因子，表明促炎Th1因子和抑炎Th2因子驅(qū)動的免疫反應(yīng)在根尖周病變中共存。研究表明，促炎Th1和抑炎Th2細(xì)胞因子均可調(diào)節(jié)IL-1的表達(dá)，IL-1被認(rèn)為是骨破壞的中心介體，IL-6刺激骨吸收，而IL-4和IFN-γ對破骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，IL-4抑制促炎細(xì)胞因子(包括IL-1和TNF-α)的合成，TNF-α及IL-4參與了Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的調(diào)控過程[4, 10, 15-17]。

Figure 8.The density of TNF-α-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖8 各組根尖周組織TNF-α-CD14雙陽性細(xì)胞密度的比較

Figure 9.The density of IL-4-CD14 double-positive cells. Mean±SEM.*P<0.05vshealthy control group;▲P<0.05vschronic periapical abscess group.

圖9 各組根尖周組織IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞密度的比較

目前，尚未見人慢性根尖周炎組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞表達(dá)的報道。為進(jìn)一步研究CD14陽性細(xì)胞Th1和Th2極化情況，本實驗選擇TNF-α作為Th1細(xì)胞因子，IL-4為Th2細(xì)胞因子，采用免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病組織中TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞的分布并分析雙陽性細(xì)胞的密度。本實驗結(jié)果與Araujo-Pires等[18]和Fukada 等[19]的結(jié)果相似，Araujo-Pires等[18]觀察到，根尖周病變的活動性與促炎介質(zhì)如TNF-α、IL-21、IL-17和IFN-γ的高表達(dá)相關(guān)，而病變的非活動期與抑炎介質(zhì)如Foxp3、IL-10、IL-9、IL-4和IL-22的表達(dá)相關(guān)。Fukada 等[19]的結(jié)果提示，炎癥肉芽腫的破骨細(xì)胞活性與Th1反應(yīng)相關(guān)，根尖周囊腫與Th2活性增強(qiáng)相關(guān)，但他們的報道并未分析具體免疫細(xì)胞炎癥介質(zhì)的表達(dá)情況。Rider等[20]研究表明，TLR2、TLR4和CD14是調(diào)節(jié)感染根管的混合感染及其所致根尖周組織破壞的關(guān)鍵因素。

綜上所述，TNF-α-CD14及IL-4-CD14雙陽性細(xì)胞如何參與根尖周病的免疫調(diào)控機(jī)制尚不清楚。根尖周組織中Th細(xì)胞因子的表達(dá)對根尖周病免疫病理的調(diào)節(jié)，以及Th1/Th2細(xì)胞因子間相互作用的機(jī)制尚需進(jìn)一步探究。