董 燕， 杜開先， 賈天明， 王 軍， 張 燕， 李 林， 關(guān) 靜， 陳 豪

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院1小兒神經(jīng)內(nèi)科， 2腦癱康復(fù)科， 3河南省紅十字血液中心檢驗科， 河南 鄭州 450052)

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocytes，AS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的最主要組成細(xì)胞[1]。縫隙連接(gap junction，GJ)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)AS間的直接通訊通道，而縫隙連接蛋白(connexin，Cx)是GJ的基本結(jié)構(gòu)和功能蛋白。縫隙連接蛋白43(connexin 43，Cx43)在AS的縫隙連接中數(shù)量最為豐富、分布最為廣泛[2]，參與了感染、外傷、缺血缺氧和免疫等多種病理、生理反應(yīng)[3]。因此，研究Cx43的調(diào)控機制有利于深入了解神經(jīng)系統(tǒng)疾病，為新的治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病方法的產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。

微小RNA(microRNA，miRNA，miR)在真核生物中廣泛表達(dá)，是一類重要的調(diào)節(jié)生物學(xué)功能的非編碼RNA，在哺乳動物中超過50%以上的蛋白質(zhì)編碼受到miRNA的調(diào)控。miRNA通過對靶基因調(diào)控參與凋亡、增殖、分化和新陳代謝等眾多的生物學(xué)功能[4-5]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miR-301a-3p在細(xì)菌性腦膜炎腦組織中高表達(dá)，miR-301a-3p和Cx43 mRNA在腦膜炎腦組織中表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)性。通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)Cx43是miR-301a-3p的潛在靶基因，但是其具體作用的靶基因位點和調(diào)控作用尚需進行深入研究。

材 料 和 方 法

1 主要材料

SPF級SD新生大鼠(1～10 d)，雌雄不限，購于鄭州大學(xué)實驗動物中心,動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(豫)2010-002。pEZX-MT05雙螢光素酶報告基因載體、pcDNA3.1真核表達(dá)載體和pEZX-MT05-Cx43購于鄭州樂睿生物科技有限公司； AZreadyTM快速E.ColiTop10感受態(tài)細(xì)胞購于北京安贊諾生物科技有限公司；Annexin V 凋亡檢測試劑盒購于上海貝博生物公司；Cx43抗體購于Abcam；化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購于安發(fā)瑪西亞生物技術(shù)有限公司；總RNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR購自Invitrogen；EndoFectinTMMax和Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit購自GeneCopoeia。

2 主要方法

2.1星型膠質(zhì)細(xì)胞獲取與培養(yǎng) 將新生的SD大鼠低溫麻醉，采用頸部脫臼處死大鼠，在無菌條件下迅速取出大腦，用D-Hanks液清洗后，解剖鏡下將腦膜和血管除去，分離出海馬組織，將其剪成約0.5 mm×0.5 mm×0.5 mm大小，用200目鋼絲篩網(wǎng)過濾后，消化、過濾、離心、重懸細(xì)胞。細(xì)胞懸液差速離心貼壁40 min，吸出懸液，以1×109/L的濃度轉(zhuǎn)移到75 cm2培養(yǎng)瓶(經(jīng)L-多聚賴氨酸包被)，加入培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2孵箱中用DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)7～9 d。待細(xì)胞融合至70%～80%時，將培養(yǎng)瓶置于搖床上37 ℃、240 r/min搖18 h，將培養(yǎng)基和懸浮細(xì)胞傾倒，用D-Hanks清洗3次。將獲得的細(xì)胞進行傳代培養(yǎng)即得到純化的AS，細(xì)胞呈星形或梭形，突起較長，核大，有個核仁，居于核中央，胞質(zhì)豐富，境界清楚。

2.2miRNA合成和轉(zhuǎn)染細(xì)胞 按照轉(zhuǎn)染物不同分為空白對照組(細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不進行轉(zhuǎn)染)、轉(zhuǎn)染miR-NC組、轉(zhuǎn)染miR-301a-3p agomir和轉(zhuǎn)染miR-301a-3p antagomir組。參考轉(zhuǎn)染試劑盒EndoFectinTMMax的說明書 將miR-NC、miR-301a-3p agomir和miR-301a-3p antagomir分別轉(zhuǎn)染到星型膠質(zhì)細(xì)胞中。

2.3qRT-PCR檢測miR-301a-3p的表達(dá) 采用總RNA提取試劑盒提取各組細(xì)胞中總RNA，用紫外分光光度計檢測A260/A280，計算獲得的RNA的純度和濃度。采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1.0 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-301a-3p的上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGCAGTGCAAT-3′,下游引物序列為5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;U6的上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA,下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT。采用熒光定量PCR儀擴增檢測miR-301a-3p，反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s、65 ℃ 15s、72 ℃ 30 s，共進行40 個循環(huán)。以U6為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計算miR-301a-3p的相對表達(dá)量。

2.4Western blot檢測Cx43蛋白的表達(dá) 取各組細(xì)胞，放入裂解液中裂解，收集裂解液，離心后取上清，BCA方法將蛋白定量。經(jīng)SDS-PAGE后將獲得的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加稀釋(1∶1 000)的 I 抗(Cx43抗體)4 ℃過夜；TBST洗3遍；加稀釋(1∶1 000)的 II 抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG)；采用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒檢測信號。使用β-actin作為內(nèi)參照，分析Cx43蛋白的相對表達(dá)量。

2.5雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?構(gòu)建含有Cx34 野生型(wild type,wt)和突變型(mutant，mut)3′-UTR的螢光素酶雙報告基因載體wt-pEZX-MT05-Cx43(wt-Cx43)和mut-pEZX-MT05-Cx43(mut-Cx43)，將其與miR-301a-3p agomir或miR-NC 兩兩組合共轉(zhuǎn)染到AS中。按照EndoFectinTMMax EF003說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，依據(jù)Secrete-Pair Dual Luminescence Assay Kit LF031說明書測定各組細(xì)胞螢光素酶活性。

2.6回復(fù)實驗 PCR擴增不含3′-UTR的Cx43片段，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Cx43，將pcDNA3.1-Cx43轉(zhuǎn)染至大鼠海馬AS中，同時將miR-NC或miR-301a-3p agomir與其共同轉(zhuǎn)染；設(shè)置未轉(zhuǎn)染的空白對照以及單獨轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-Cx43、miR-NC和miR-301a-3p agomir作為對照。依據(jù)實驗需求48 h后收集各組細(xì)胞，Western blot檢測Cx43蛋白表達(dá)。

2.7流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡情況 采用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)對各組細(xì)胞凋亡情況進行檢測。將對數(shù)生長期的細(xì)胞制備成1×109/L的單細(xì)胞懸液，采用Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒檢測細(xì)胞凋亡。在細(xì)胞中依次加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育后，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，在30 min中檢測完成。用Diva軟件分析實驗結(jié)果，計算各組細(xì)胞的凋亡比，每組細(xì)胞重復(fù)檢測3次。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗結(jié)果進行處理分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多項指標(biāo)間比較用單因素方差分析進行統(tǒng)計，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 AS中miR-301a-3p表達(dá)的檢測

將miR-301a-3p agomir轉(zhuǎn)染到AS后，miR-301a-3p相對表達(dá)量為4.31±0.51，其表達(dá)水平較blank組(1.00±0.12)和miR-NC組(1.18±0.14)顯著升高(P<0.05);而miR-301a-3p antagomir 轉(zhuǎn)染后，miR-301a-3p相對表達(dá)量為0.47±0.12，其表達(dá)水平與blank組和miR-NC組相比顯著降低(P<0.05);miR-NC組和blank組比較，miR-301a-3p表達(dá)水平無顯著改變(P>0.05),見圖1。

2 AS中 Cx43蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果

將miR-301a-3p agomir、miR-301a-3p antagomir和miR-NC轉(zhuǎn)染到AS后，Western blot分析Cx43蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示,miR-301a-3p agomir轉(zhuǎn)染后，Cx43 蛋白相對表達(dá)量為0.34±0.05，其表達(dá)水平較blank組(0.63±0.05)和miR-NC組(0.69±0.05)顯著降低(P<0.05);而miR-301a-3p antagomir 轉(zhuǎn)染后，miR-301a-3p相對表達(dá)量為0.89±0.08，其表達(dá)水平與blank組和miR-NC組比較顯著升高(P<0.05);轉(zhuǎn)染miR-NC后，miR-301a-3p表達(dá)水平較blank組沒有明顯改變(P>0.05),這提示miRNA-301a-3p對Cx43蛋白表達(dá)有抑制作用,見圖2。

Figure 1.The expression of miR-301a-3p in the AS after transfection with miRNA-301a-3p agomir and antagomir. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsmiR-301a-3p agomir group.

圖1 miRNA-301a-3p agomir 和 antagomir對AS中miR-301a-3p表達(dá)的影響

Figure 2.The effect of miR-301a-3p on Cx43 expression in the AS. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsmiR-301a-3p agomir group.

圖2 miR-301a-3p高表達(dá)對AS中Cx43蛋白表達(dá)的影響

3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

依據(jù)TagrgetScan(http://www.targetscan.org/)、DIAN A-microT(http: //diana.imis.athena-innovation.gr/)和mirdb.org(http://www.mirdb.org/)3個miRNA的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析,我們發(fā)現(xiàn)Cx43是miR-301a-3p的潛在靶基因，確定miR-301a-3p和Cx43 3′-UTR相互作用位點，見圖3。構(gòu)建雙螢光素酶報告基因載體，與miR-301a-3p agomir或miR-NC 兩兩組合，一起轉(zhuǎn)染AS中，分析各組熒光信號的變化，結(jié)果顯示將wt-Cx43和miR-301a-3p共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的螢光素酶活性受到抑制，較miR-NC 和wt-Cx43共轉(zhuǎn)染組相比顯著降低(P<0.05)；而miR-301a-3p agomir和mut-Cx43共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的螢光素酶活性較miR-NC和mut-Cx43共轉(zhuǎn)染組相比沒有明顯變化(P>0.05)，見圖3。這表明miR-301a-3p能夠與Cx43 3′-UTR結(jié)合，對其表達(dá)產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作。

Figure 3.Dual-luciferase reporter assay of Cx43 and miR-301a-3p. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group.

圖3 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果

4 回復(fù)實驗結(jié)果

將不含3′-UTR的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Cx43轉(zhuǎn)染到AS中，與miR-301a-3p agomir(或miR-NC)共同轉(zhuǎn)染細(xì)胞，以探討Cx43過表達(dá)后是否能夠回復(fù)miR-301a-3p對Cx43蛋白表達(dá)的抑制作用，同時將miR-301a-3p agomir(或miR-NC)單獨轉(zhuǎn)染到AS中作為對照。Western blot結(jié)果顯示，單獨轉(zhuǎn)染miR-301a-3p agomir時Cx43蛋白表達(dá)降低，而pcDNA3.1-Cx43和miR-301a-3p agomir共同轉(zhuǎn)染后引起細(xì)胞Cx43過表達(dá)，即pcDNA3.1-Cx43回復(fù)了miR-301a-3p對Cx43蛋白表達(dá)的抑制作用，見圖4。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

采流式細(xì)胞術(shù)檢測分析各組細(xì)胞凋亡率，實驗結(jié)果顯示miR-301a-3p轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞凋亡率為(5.93±0.93)%，與blank組[(7.11±0.74)%]比較顯著降低(P<0.05)，而pcDNA3.1-Cx43轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的凋亡率為(18.40±1.98)%，與miR-NC組相比顯著升高(P<0.05)，提示Cx43蛋白的高表達(dá)促進了AS的凋亡；同時將pcDNA3.1-Cx43和miR-301a-3p共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后細(xì)胞的凋亡率為(17.42±1.36)%，較miR-NC組相比顯著升高(P<0.05)，進一步說明由于Cx43 3′-UTR缺失，miR-301a-3p無法抑制Cx43蛋白的表達(dá)，從而使miR-301a-3p對AS凋亡的抑制作用消失，見圖5。因此Cx43 3′-UTR是miR-301a-3p的作用靶點，通過對Cx43蛋白表達(dá)的調(diào)控，miR-301a-3p抑制了AS的凋亡。

Figure 4.The effect of co-transfection miR-301a-3p and pcDNA3.1-Cx43 without 3′-UTR on Cx43 expression. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-NC group;#P<0.05vsmiR-301a-3p group.

圖4 miR-301a-3p與pcDNA3.1-Cx43共轉(zhuǎn)染對Cx43蛋白表達(dá)的影響

討 論

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)目最多、體積較大的一類細(xì)胞，其數(shù)量為神經(jīng)元的10～50倍，約占腦組織體積的一半。AS是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主體，與神經(jīng)元之間有著復(fù)雜的相互作用，通過廣泛的GJ，在細(xì)胞間傳遞氨基酸、維生素、激素等物質(zhì)[6]。AS在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)組織的修復(fù)和再生、突觸傳遞、抗氧化、神經(jīng)元周圍內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)、神經(jīng)免疫等多個生理、病理過程中起著十分重要的作用[7-8]。Cx43 蛋白及其組成的GJ在多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸中起到重要作用。在前期的研究中我們發(fā)現(xiàn)細(xì)菌性腦膜炎大鼠模型中Cx43蛋白表達(dá)異常，因此本研究意在尋找對Cx43進行調(diào)控的miRNA。

目前已有大量的研究證實miRNA在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮調(diào)控作用，對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用[9]。在腦外傷、腦出血、癲癇、神經(jīng)退行性疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，miRNA表達(dá)譜發(fā)生改變，參與了這些疾病的發(fā)生、發(fā)展[10-12]。Hua等[13]研究發(fā)現(xiàn)在小鼠神經(jīng)組織中存在30多個特異性表達(dá)的miRNAs。Wheeler等[14]發(fā)現(xiàn)在小鼠胚胎腦組織中存在多個新的miRNAs，其在脊髓和腦中特異性的表達(dá)。這些miRNAs能對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育和功能產(chǎn)生精確的調(diào)控，其調(diào)控紊亂則會引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病的產(chǎn)生[15]。

Figure 5.The effect of co-transfection miR-301a-3p and pcDNA3.1-Cx43 without 3′-UTR on the cell apoptosis. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsblank group;#P<0.05vsmiR-NC group；△P<0.05vsmiR-301a-3p group.

圖5 miR-301a-3p與pcDNA3.1-Cx43共轉(zhuǎn)染對細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的影響

通過miRNA的靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)Cx43是miR-301a-3p潛在靶基因，而利用miR-301a agomir 和 miR-301a-3p antagomir使AS中miR-301a-3p高表達(dá)和表達(dá)抑制后，Cx43蛋白表達(dá)隨之增高和降低，這提示AS中miR-301a-3p可能對Cx43表達(dá)進行調(diào)控。我們將Cx43 3′-UTR野生型和突變型片段分別克隆到pEZX-MT05，以鑒定miR-301a-3p和Cx43 mRNA的結(jié)合位點，結(jié)果顯示野生型Cx43 mRNA的3′-UTR 能夠與miR-301a-3p發(fā)生結(jié)合，引起螢光素酶活性的降低。而突變型Cx43 mRNA的3′-UTR無法與miR-301a-3p發(fā)生結(jié)合，因此螢光素酶活性沒有變化，因此Cx43 mRNA的3′-UTR是miR-301a-3p特異性作用靶點，能夠與其進行結(jié)合，對Cx43的mRNA進行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。

雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)miR-301a-3p能夠與Cx43 mRNA的3′-UTR特異性結(jié)合，抑制Cx43的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，但是尚不能排除miR-301a-3p能夠與Cx43 ORF區(qū)結(jié)合，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。因此我們設(shè)計了回復(fù)實驗排除此種可能。通過設(shè)計Cx43過表達(dá)載體pcDNA3.1-Cx43，轉(zhuǎn)染到AS中，同時我們設(shè)計了空白載體作為對照，結(jié)果顯示pcDNA3.1-Cx43轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Cx43蛋白表達(dá)升高，而miR-301a-3p agomir共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中Cx43蛋白并未降低，說明不含3′UTR的Cx43過表達(dá)載體能夠回復(fù)miR-301a-3p對其表達(dá)的抑制作用，miR-301a-3p需要通過與Cx43 mRNA的3′-UTR特異性結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式細(xì)胞實驗顯示pcDNA3.1-Cx43能夠回復(fù)miR-301a-3p對AS凋亡的抑制作用，促進細(xì)胞的增殖。miR-301a-3p需作用于Cx43 mRNA的3′-UTR從而在AS中發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。

本研究結(jié)果顯示Cx43是miR-301a-3p的一個靶基因，miR-301a-3p對Cx43的調(diào)控在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。但是miRNA的調(diào)控機制非常復(fù)雜，一個miRNA可能有多個靶基因，一種基因的表達(dá)調(diào)控也會涉及多種調(diào)控因素。因此，對于miRNA-301a-3p的調(diào)控機制有待更深入的研究。