張 平， 袁曉慧， 喻婷婷， 黃華坤, 楊春梅， 張露露， 羅小輯， 羅進(jìn)勇△

(1重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 2重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科， 重慶 400016)

結(jié)直腸癌是全球常見的消化道惡性腫瘤之一。在我國，結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率在全部惡性腫瘤中均位于第5名[1]，嚴(yán)重威脅人們的健康。目前臨床結(jié)直腸癌治療使用的化療藥物有很多，但轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸患者5年生存率僅約10%[2]，這是由于劑量毒副作用及其對化療藥物反應(yīng)的異質(zhì)性等，這種異質(zhì)性是由結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中不同原癌及抑癌基因的累積突變及復(fù)雜的信號通路改變等導(dǎo)致的。因此，探索安全有效的化療藥物對結(jié)直腸癌治療具有重要意義。石蒜堿(lycorine)是從中國廣泛分布的石蒜科中最早分離得到的石蒜屬植物生物堿，屬于異喹啉類生物堿，為吡咯并菲啶的衍生物，具有乙酰膽堿酯酶抑制、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗真菌、抗瘧疾和抗病毒等生物學(xué)作用[3]。此外，lycorine具有對多種器官腫瘤細(xì)胞的抗腫瘤活性，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[4]、肺癌[5]、膀胱癌[6]、前列腺癌[7]和肝癌[8]等，但對結(jié)直腸癌的影響機(jī)制尚不明確。因此，本項(xiàng)工作通過體外實(shí)驗(yàn)檢測lycorine處理后人結(jié)腸腺癌LoVo細(xì)胞的增殖、凋亡和遷移侵襲能力改變情況，并探討其可能的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞株 人結(jié)腸腺癌LoVo細(xì)胞株由重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?，接種于含10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱。細(xì)胞生長至融合度70%～80%時，0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞傳代。

1.2藥物與主要試劑 lycorine(純度≥98%)購自成都瑞芬思生物科技有限公司,用助溶劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解后于-20 ℃保存待用;CCK-8試劑盒購于Med Chem Express；基質(zhì)膠購自BD Biosciences； Hoechst 33258染液購自Solarbio； LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Thermo Fisher；螢光素酶報告基因質(zhì)粒pBGLuc Elk1/SRF TOP-Luc由美國芝加哥大學(xué)醫(yī)學(xué)中心分子腫瘤學(xué)實(shí)驗(yàn)室何通川教授惠贈；螢光素酶檢測試劑盒購自New England Biolabs；結(jié)晶紫染液、蛋白提取試劑盒和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；Transwell小室購自Millipore；兔抗人增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、兔抗人cleaved caspase-3、兔抗人caspase-3、兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase-7，MMP-7)、鼠抗人E-cadherin、兔抗人N-cadherin、兔抗人ERK1/2、兔抗人p-ERK1/2和鼠抗人β-actin抗體均購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠 IgG購自中杉金橋有限公司。

1.3主要儀器 酶聯(lián)免疫檢測儀Eon為香港基因有限公司公司產(chǎn)品；倒置熒光顯微鏡ECLIPSE Ti-S為Nikon公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞儀CytoFLEX為Beckman Coulter公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像儀ChemiDoc XRS+為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1CCK-8法檢測lycorine對LoVo細(xì)胞的活力抑制作用 lycorine作用于人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞72 h后半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約3.0 μmol/L[9]，其對多種腫瘤細(xì)胞的IC50在1～10 μmol/L[9-12]，因此本文采用1、2、4和8 μmol/L濃度梯度處理LoVo細(xì)胞，且以下實(shí)驗(yàn)均同時設(shè)置空白對照組(0 μmol/L lycorine)及DMSO組(濃度為0.4%)。LoVo細(xì)胞以每孔3 000個的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁生長，lycorine處理細(xì)胞至24 h、48 h及72 h。按照CCK-8試劑盒操作說明書，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育1 h。酶標(biāo)儀測量波長450 nm處吸光度(A)值，計算細(xì)胞相對活力。細(xì)胞相對活力(%)=處理組A/空白對照組A×100%。

2.2劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測lycorine對LoVo細(xì)胞遷移的抑制作用 LoVo細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞融合度為 80%～90% 時，用10 μL 移液器吸頭在細(xì)胞面進(jìn)行劃痕， PBS 漂洗 3 次，lycorine處理細(xì)胞，顯微鏡觀察記錄同一劃痕處0 h、12 h和24 h時點(diǎn)的變化，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

2.3Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測lycorine對LoVo細(xì)胞侵襲的抑制作用 Transwell上室鋪基質(zhì)膠(基質(zhì)膠原液∶雙無培養(yǎng)液=1∶10)每孔30 μL。待基質(zhì)膠凝固后，棄去上室雙無培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期細(xì)胞，雙無培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×108/L。上室加入細(xì)胞懸液400 μL，并調(diào)整lycorine處理濃度，同時設(shè)置DMSO組，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)液。置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后取出，PBS漂洗2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，結(jié)晶紫染液染色5 min, PBS洗滌去除殘余結(jié)晶紫染液，棉簽將上室內(nèi)未穿過的細(xì)胞拭去。干燥后，顯微鏡下觀察記錄遷移到小室下層的細(xì)胞。

2.4Hoechst 33258染色法檢測lycorine對LoVo細(xì)胞凋亡的影響 LoVo細(xì)胞接種于24孔板，待細(xì)胞生長至密度為50%，lycorine處理細(xì)胞24 h后，棄去培養(yǎng)液，PBS 洗滌2次，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞 20 min，PBS 洗滌2次，每孔加入 Hoechst 33258工作液(將原液稀釋100倍)200 μL，室溫避光反應(yīng)5～7 min，棄去 Hoechst 33258工作液，PBS洗滌2次，倒置熒光顯微鏡下觀察記錄細(xì)胞核形態(tài)變化。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染。

2.5流式細(xì)胞術(shù)檢測lycorine對LoVo細(xì)胞凋亡的影響 LoVo細(xì)胞接種于6 cm培養(yǎng)皿，待細(xì)胞生長至密度為50%，lycorine處理細(xì)胞24 h后，0.25%胰蛋白酶消化，150×g轉(zhuǎn)速離心3 min。棄上清并加入3 mL PBS重懸細(xì)胞，重復(fù)2次，最后加入500 μL PBS重懸細(xì)胞。按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒參考方法進(jìn)行染色，最后經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

2.6螢光素酶報告基因系統(tǒng)試驗(yàn)檢測MAPK/ERK信號通路活性變化 LoVo細(xì)胞接種于 T25 培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞融合度為 50%，將含10% FBS的培養(yǎng)液換為雙無培養(yǎng)液，LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染螢光素酶報告質(zhì)粒p-BGLuc Elk1/SRF TOP-Luc。轉(zhuǎn)染4 h后，換液為含10% FBS的培養(yǎng)液，細(xì)胞過夜培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化，細(xì)胞接種于24 孔板，待細(xì)胞融合度為 50%，不同濃度(2、4、8和12 μmol/L)lycorine處理細(xì)胞24 h，按照螢光素酶活性檢測試劑盒參考方法檢測各組熒光強(qiáng)度。MAPK/ERK信號通路激活后，核內(nèi)Elk1/SRF轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，進(jìn)而調(diào)控靶基因表達(dá)。因此Elk1/SRF轉(zhuǎn)錄活性與MAPK/ERK信號通路活性正相關(guān)。各組螢光素酶活性值表示Elk1/SRF 轉(zhuǎn)錄活性，以此反映MAPK/ERK信號通路活性變化。

2.7Western blot 不同濃度(1、4和8 μmol/L)lycorine處理細(xì)胞24 h后，提取總蛋白。蛋白上樣，10% SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)膜，5% BSA封閉液封閉2 h，Ⅰ抗置于4 ℃孵育過夜，洗膜3次，于37 ℃孵育HRP標(biāo)記的Ⅱ抗，洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影。顯影結(jié)果通過ImageJ軟件分析各電泳條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照，得出各蛋白的相對表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件和GraphPad Prism 5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 lycorine抑制LoVo細(xì)胞的活力

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LoVo細(xì)胞經(jīng)1、2、4和8 μmol/L lycorine處理24 h、48 h及72 h后，與空白對照組對比，其細(xì)胞生長受到不同程度抑制，且具有濃度和時間依賴性(P<0.05);DMSO組與空白對照組相比無顯著差異(P>0.05),見圖1A。同時，Western blot結(jié)果顯示，lycorine使PCNA蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),見圖1B。

2 lycorine對LoVo細(xì)胞凋亡無影響

Hoechst染色結(jié)果顯示,lycorine處理組LoVo細(xì)胞胞核與空白對照組形態(tài)相似，致密濃染或碎塊狀致密濃染少見，見圖2A。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，lycorine處理組早期及晚期凋亡率與空白對照組無顯著差異(P>0.05)，見圖2B。Western blot證實(shí)，與空白對照組相比，lycorine處理組caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，見圖2C。

3 lycorine抑制LoVo細(xì)胞遷移侵襲能力

劃痕愈合實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，2、4和8 μmol/L lycorine處理LoVo細(xì)胞24 h后，細(xì)胞劃痕愈合率較空白對照組顯著降低(P<0.05)，見圖3A。Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,lycorine處理組穿膜細(xì)胞數(shù)目較空白對照組顯著減少(P<0.05)，見圖3B。Western blot檢測,MMP-7和N-cadherin蛋白表達(dá)水平下調(diào), E-cadherin蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05)，見圖3C。

4 MAPK/ERK信號通路參與lycorine對LoVo細(xì)胞的調(diào)節(jié)

螢光素酶報告基因系統(tǒng)結(jié)果顯示，與空白對照組相比，4、8和12 μmol/L lycorine處理組螢光素酶活性顯著降低(P<0.05)，見圖4A。Western blot檢測LoVo細(xì)胞中磷酸化ERK1/2蛋白水平顯著下調(diào)，同時ERK1/2總蛋白表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)，見圖4B。

Figure 1.Effects of lycorine on viability of LoVo cells. A: the viability of LoVo cells treated with different concentrations (1, 2, 4 and 8 μmol/L) of lycorine for 24 h, 48 h and 72 h was detected by CCK-8 assay; B: the protein level of PCNA was detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖1 lycorine對LoVo細(xì)胞活力的影響

討 論

隨著結(jié)直腸癌患者的治療朝向個體化精準(zhǔn)治療發(fā)展，術(shù)前及術(shù)后的輔助化療面臨新的，有效且毒副作用小的化療藥物需求。本研究探討的lycorine是從石蒜科植物中提取的一種天然成分，其具有多種合成衍生物及類似物，但lycorine展現(xiàn)出更高的抗腫瘤活性[12]。有研究顯示，lycorine對人胚肺成纖維W138細(xì)胞及人皮膚成纖維細(xì)胞(WS1和NHDF)產(chǎn)生毒性作用的濃度大于100 μmol/L[9]；與人支氣管上皮BEAS-2B細(xì)胞相比，lycorine對5種人腫瘤細(xì)胞株(骨髓白血病HL-60及K562細(xì)胞、肺癌A549細(xì)胞、肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞和結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞)的毒性選擇性指數(shù)高達(dá)10[13]。以上研究說明lycorine具有一定的選擇性細(xì)胞毒性作用，利于抗腫瘤治療應(yīng)用。

本研究證實(shí)了lycorine對LoVo細(xì)胞生物學(xué)功能的抑制作用，且在一定濃度內(nèi)呈劑量和時間依賴性。據(jù)報道，lycorine可通過抑制Wnt/β-catenin信號、逆轉(zhuǎn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)以及干預(yù)caspase介導(dǎo)的線粒體凋亡通路來抑制小細(xì)胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移[5]；通過阻斷STAT3信號通路及Src/FAK通路來抑制乳腺癌的增殖侵襲及促進(jìn)凋亡[14-15]。但是對于部分腫瘤，lycorine通過細(xì)胞生長抑制而非細(xì)胞毒作用發(fā)揮其體外抗腫瘤活性，對凋亡抗性的腫瘤細(xì)胞是潛在的治療藥物[12]。本文結(jié)果顯示lycorine對LoVo細(xì)胞凋亡無影響，表明其主要發(fā)揮細(xì)胞生長抑制作用。本研究使用的結(jié)直腸癌LoVo細(xì)胞株具有高度的EMT，惡性程度高，且KRAS基因突變。在腫瘤轉(zhuǎn)移中，上皮腫瘤細(xì)胞可通過EMT獲得遷移侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展[16]。本研究表明lycorine可通過上調(diào)E-cadherin及下調(diào)MMP-7和N-cadherin而抑制EMT過程，從而抑制LoVo細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中，原癌基因KRAS突變是一個重要的分子事件。既往研究報道，約30%～40%的結(jié)直腸癌原癌基因KRAS發(fā)生突變，KRAS可作為判定結(jié)直腸癌惡性程度的分子指標(biāo)之一[17-19]。KRAS是EGFR信號通路的下游組分之一，其異常突變會導(dǎo)致EGF/RAS/RAF/MEK/ERK持續(xù)激活[20]。而MAPK/ERK信號通路可調(diào)控細(xì)胞生長，存活及侵襲，與結(jié)直腸癌的進(jìn)展密切相關(guān)，因此靶向MAPK/ERK是治療結(jié)直腸癌的一種方式[21]。本研究檢測lycorine顯著下調(diào)ERK1/2蛋白磷酸化水平，降低Elk1/SRF轉(zhuǎn)錄活性，提示lycorine對LoVo細(xì)胞的抗腫瘤作用與MAPK/ERK信號通路抑制有關(guān)。

Figure 2.Effects of lycorine on apoptosis of LoVo cells. A and B: the apoptosis of LoVo cells was detected by Hoechst staining and flow cytometry; C: the protein levels of caspase-3 and cleaved caspase-3 were detected by Western blot. The scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.

圖2 lycorine對LoVo細(xì)胞凋亡的影響

Figure 3.Effects of lycorine on migration and invasion abilities of LoVo cells. A and B: the inhibitory effect of lycorine on migration and invasion abilities of LoVo cells was tested by wound-healing assay and Transwell chamber assay (crystal violet staining); C: the protein expression of EMT-related markers was determined by Western blot. The scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖3 lycorine對LoVo細(xì)胞遷移和侵襲能力的作用

Figure 4.Effects of lycorine on activation of MAPK/ERK pathway in LoVo cells. A: after treatment with different concentrations of lycorine, the activity of MAPK/ERK signaling pathway was detected by luciferase reporter assay; B: the protein expression of p-ERK1/2 and total ERK1/2 was measured by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsblank control group.

圖4 lycorine對LoVo細(xì)胞MAPK/ERK信號通路活性的影響

綜上所述，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)lycorine可通過抑制EMT過程及MAPK/ERK信號通路活性而降低LoVo細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，但對細(xì)胞凋亡無影響，提示其主要發(fā)揮細(xì)胞生長抑制作用。該研究可為結(jié)直腸癌治療提供一定參考資料。后續(xù)本課題組將進(jìn)一步研究體內(nèi)試驗(yàn)并深入探討lycorine的作用機(jī)制以及與其他抗癌藥物聯(lián)合治療的效果。