石哲瑋， 劉勝新， 詹嘉琛， 金佳麗， 陳瑩瑩， 秦鋮璠， 錢(qián)彩珍△

(1紹興文理學(xué)院附屬諸暨醫(yī)院心血管內(nèi)科, 浙江 諸暨 311800; 2溫州醫(yī)科大學(xué)， 浙江 溫州 325000)

病毒性心肌炎是一種心臟炎癥性疾病，可由多種感染因素引起，同時(shí)也是青年患者猝死的重要原因之一[1]。多種已知的病毒感染可引起病毒性心肌炎的發(fā)生，其中以引起腸道和上呼吸道感染的病毒最為多見(jiàn)。病毒性心肌炎可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病的發(fā)生，并最終演變?yōu)閻盒孕牧λソ遊2]。由于病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程尚未完全闡明，現(xiàn)有的臨床治療僅以抗病毒和對(duì)癥支持治療為主。因此，尋找能夠有效抑制病毒性心肌炎患者心臟炎癥的藥物，將有利于改善患者的臨床癥狀和遠(yuǎn)期預(yù)后。

漢黃芩苷(wogonside)是黃芩中特有的成分，具有顯著的抗腫瘤、抗血管新生和抗炎作用。既往研究表明，漢黃芩苷可通過(guò)下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中TRAF2/4表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[3],漢黃芩苷還可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin通路抑制乳腺癌血管新生[4]，漢黃芩苷亦可通過(guò)抑制NF-κB蛋白磷酸化和NLRP3炎癥小體的激活來(lái)減輕創(chuàng)傷性脊髓損傷引起的炎癥反應(yīng)[5]。本實(shí)驗(yàn)擬進(jìn)一步明確漢黃芩苷能否在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)發(fā)揮抑制心臟炎癥反應(yīng)的作用。

既往研究表明，柯薩奇B3病毒(Coxsackie virus B3，CVB3)感染可導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷和顯著的心臟炎癥反應(yīng)，同時(shí)可伴有大量炎癥因子的釋放[6]，因此常被用于病毒性心肌炎模型的構(gòu)建。NF-κB通路是一條經(jīng)典的炎癥通路，其在病毒性心肌炎中的作用已被廣泛證實(shí)[7]。本研究擬采用腹腔注射CVB3構(gòu)建病毒性心肌炎動(dòng)物模型，接著給予病毒性心肌炎小鼠漢黃芩苷治療，然后通過(guò)檢測(cè)心肌組織內(nèi)NF-κB通路活化情況以及炎癥因子蛋白表達(dá)水平探究漢黃芩苷在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)發(fā)揮的抗炎作用和具體調(diào)控機(jī)制，從而為病毒性心肌炎的中醫(yī)藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1細(xì)胞與病毒株 Hep2細(xì)胞由上海生化細(xì)胞所提供。CVB3 Nancy株購(gòu)于A(yíng)TCC。病毒經(jīng)Hep2細(xì)胞活化增殖，CPE達(dá)75%以上時(shí)收獲，測(cè)定其滴度。

1.2動(dòng)物

清潔級(jí)雄性BALB/c小鼠，6～8周齡，18～20 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2012-0002。雄性BALB/c小鼠飼養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物使用許可證號(hào): SYXK(浙)2015-0009。

2 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

漢黃芩苷購(gòu)于Sigma;AKT特異性激動(dòng)劑SC79購(gòu)于MCE;兔抗小鼠白細(xì)胞介素1β(interleakin-1β, IL-1β)和IL-6單克隆抗體均購(gòu)于A(yíng)bcam；兔抗小鼠 p-AKT、AKT、p-NF-κB和NF-κB單克隆抗購(gòu)于CST；GAPDH單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG均購(gòu)于Bioworld；總RNA提取試劑盒(東洋紡)以及CVB3和GAPDH引物購(gòu)于伯信生物公司；HE染色試劑盒購(gòu)于Solarbio；ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海博谷生物科技有限公司。熒光定量PCR儀購(gòu)于Eppendorf。

3 主要方法

3.1模型構(gòu)建及動(dòng)物分組 在測(cè)定CVB3病毒滴度后，向雄性BALB/c小鼠腹腔內(nèi)注射病毒稀釋液制作病毒性心肌炎動(dòng)物模型。將小鼠隨機(jī)分為正常組(normal組)、心肌炎組(CVB3組)、漢黃芩苷治療組(CVB3 wogonoside組)以及AKT激動(dòng)劑處理組(CVB3+wogonoside+agonist組)，每組各10只。具體病毒劑量參照前期研究[8]，除正常對(duì)照組外其余各組采用腹腔接種1.0×106滴度的CVB3病毒稀釋液 0.2 mL建立病毒性心肌炎模型。漢黃芩苷治療組小鼠每天腹腔注射漢黃芩苷注射液(50 mg/kg)，正常對(duì)照組和心肌炎組每天腹腔注射等體積生理鹽水，持續(xù)7 d。7 d后麻醉處死各組小鼠，部分心肌儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)，部分心肌用4%多聚甲醛固定。AKT激動(dòng)劑處理組小鼠給予腹腔注射漢黃芩苷(50 mg/kg)及SC79溶液(40 mg/kg)處理，每天注射1次，持續(xù)7 d。7 d后麻醉處死小鼠，將心臟組織儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

3.2生化指標(biāo)檢測(cè) 處死正常組、心肌炎組和漢黃芩苷治療組小鼠前摘除眼球取血，將全血在室溫下放置1小時(shí)，待全血自然凝固并析出血清后，4 ℃、2 000×g離心10 min，離心完成后吸取黃色上清液，將血清存放于-80 ℃長(zhǎng)期保存。按照ELISA檢測(cè)試劑盒中說(shuō)明書(shū)的步驟檢測(cè)小鼠血清中IL-1β和IL-6含量。

3.3心臟組織形態(tài)學(xué)觀(guān)察 用4%多聚甲醛固定正常組、心肌炎組和漢黃芩苷治療組小鼠心臟組織，經(jīng)包埋、固定，然后行石蠟切片，HE染色后光鏡下觀(guān)察心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況。

3.4real-time PCR檢測(cè)CVB3病毒的mRNA表達(dá)量 取出放置于-80 ℃保存的各組心肌組織，提取心肌組織中總RNA并測(cè)定總RNA濃度及純度，按東洋紡逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作合成cDNA，通過(guò)Eppendorf MAS熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參照，目的基因的相對(duì)含量以2-ΔΔCt表示，引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR引物序列

3.5 Western blot 法檢測(cè)p-AKT、AKT、NF-κB、p-NF-κB、IL-1β和IL-6的蛋白水平 取各組小鼠心臟組織，裂解勻漿至液體，然后離心，超聲粉碎組織，再次離心后取上清測(cè)定蛋白含量，經(jīng)凝膠電泳分離和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST洗膜后分別加Ⅰ抗GAPDH (1∶5 000)、p-AKT(1∶1 000)、AKT(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000 )、p-NF-κB(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和IL-6(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜，Ⅱ抗室溫孵育2 h，TBST洗膜3次后用ECL試劑顯影曝光。IL-1β和IL-6以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參照，磷酸化的AKT和NF-κB分別以總AKT和總NF-κB蛋白條帶作為參照，通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image Lab圖像軟件定量分析每個(gè)條帶灰度值。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 漢黃芩苷改善心肌炎小鼠心臟炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

HE染色可見(jiàn)正常組小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)完整；心肌炎組小鼠心臟組織結(jié)構(gòu)紊亂，伴心肌間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；漢黃芩苷治療組小鼠心臟組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較心肌炎組小鼠顯著降低(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The histological changes of the heart tissues at 7 d after wogonoside treatment (HE staining, the scale bar=50 μm). Mean±SD．n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group.

圖1 治療7 d后各組小鼠心臟組織炎癥和心肌病理評(píng)分

2 漢黃芩苷下調(diào)病毒mRNA表達(dá)量

real-time PCR結(jié)果顯示，正常組小鼠心肌組織內(nèi)無(wú)CVB3 mRNA表達(dá)；心肌炎小鼠心肌組織中CVB3 mRNA表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；給予漢黃芩苷治療后心肌炎小鼠心臟組織中CVB3 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The mRNA expression of CVB3 in the heart tissues. Mean±SD．n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group.

圖2 各組小鼠心肌組織CVB3病毒mRNA的表達(dá)水平

3 漢黃芩苷下調(diào)心肌炎小鼠血清炎癥因子表達(dá)量

心肌炎組小鼠血清中IL-1β和IL-6的表達(dá)量較正常組顯著增加(P<0.05);漢黃芩苷治療后心肌炎小鼠血清中IL-1β和IL-6表達(dá)量較心肌炎組顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠心臟體重比及血清中IL-1β和IL-6的水平

Table 2.The results of heart index (HI) and serum IL-1β and IL-6 levels (Mean±SD．n=6)

GroupHI (mg/g)IL-1β (ng/L)IL-6 (ng/L)Normal4.55±0.196.84±1.3712.23±2.01CVB34.72±0.14103.16±3.84*78.12±2.36*CVB3+wogonoside4.67±0.1273.16±1.84#38.15±1.16#

*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group.

4 漢黃芩苷可能通過(guò)調(diào)控AKT和NF-κB蛋白磷酸化水平減輕心肌炎癥

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與心肌炎組相比，漢黃芩苷治療組小鼠心肌組織內(nèi)IL-1β和IL-6蛋白表達(dá)水平顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖3。與心肌炎組相比，漢黃芩苷治療組小鼠心肌組織內(nèi)p-AKT蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)，同時(shí)p-AKT/AKT的比值顯著降低 (P<0.05)；p-NF-κB蛋白表達(dá)顯著減少(P<0.05)，同時(shí)p-NF-κB/NF-κB的比值顯著降低 (P<0.05)，見(jiàn)圖4。

5 AKT/NF-κB通路是漢黃芩苷發(fā)揮抗炎作用的通路之一

Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與AKT激動(dòng)劑合用后，漢黃芩苷對(duì)于NF-κB蛋白磷酸化水平的抑制作用顯著減弱(P<0.05)；同時(shí)，小鼠心肌組織中IL-β和IL-6的含量較漢黃芩苷治療組顯著升高，表明漢黃芩苷減輕病毒性心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)的作用顯著受到抑制(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

Figure 3.The levels of IL-6 and IL-1β in the heart tissues. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group.

圖3 各組小鼠心肌組織炎癥因子IL-6和IL-1β的蛋白水平

Figure 4.The protein levels of p-AKT、AKT、p-NF-κB and NF-κB in the heart tissues. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group.

圖4 各組小鼠心肌組織中p-AKT、AKT、p-NF-κB和NF-κB 的蛋白水平

討 論

病毒性心肌炎是一種由于病毒感染引起的心肌局限性或彌漫性的炎癥性疾病,可由多種病毒感染引起，其中，柯薩奇病毒，同其它腸道小RNA病毒一起導(dǎo)致了超過(guò)50%的急性心肌炎和大約25%的擴(kuò)張型心肌病[9]。病毒性心肌炎的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，多認(rèn)為與病毒直接損傷心肌組織以及機(jī)體自身不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)相關(guān)。若在病毒性心肌炎患者發(fā)病早期不給予有效的臨床治療，那么即使患者有幸生還，隨著病程的進(jìn)展部分患者仍可進(jìn)一步演變?yōu)閿U(kuò)張型心肌病。因此，尋找更多能夠有效治療病毒性心肌炎患者急性期炎癥反應(yīng)的藥物有利于改善患者的遠(yuǎn)期預(yù)后。

Figure 5.The protein levels of p-AKT, AKT, p-NF-κB, NF-κB, IL-6 and IL-1β in the heart tissues. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsCVB3 group;&P<0.05vsCVB3+wogonoside group.

圖5 各組小鼠心肌組織中p-AKT、AKT、p-NF-κB、NF-κB、IL-6和IL-1β蛋白水平

近來(lái)研究表明漢黃芩苷作為黃芩的重要組成部分，在多種疾病中發(fā)揮重要的保護(hù)作用。漢黃芩苷可減輕由硫酸葡聚糖鈉造成的結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織損傷[10]；可通過(guò)抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞增生和肥大過(guò)程，改善骨關(guān)節(jié)炎癥狀[11]；還可以減少脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷[12]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步挖掘漢黃芩苷在病毒性心肌炎治療中的潛力。本研究結(jié)果表明給予漢黃芩苷治療能夠顯著減少病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，同時(shí)可下調(diào)病毒性心肌炎小鼠血清及心肌組織內(nèi)炎癥因子IL-1β和IL-6的蛋白表達(dá)。以上結(jié)果表明，漢黃芩苷可抑制病毒性心肌炎急性期小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

為了進(jìn)一步闡明漢黃芩苷在病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)發(fā)揮抗炎作用的具體機(jī)制，本研究通過(guò)檢測(cè)炎癥相關(guān)通路蛋白磷酸化水平來(lái)探究漢黃芩苷發(fā)揮抗炎作用的主要靶點(diǎn)。既往研究表明NF-κB和JAK/STAT兩條經(jīng)典的炎癥通路參與病毒性心肌炎的發(fā)生發(fā)展過(guò)程[13-14]。通過(guò)調(diào)控NF-κB和STAT3蛋白磷酸化水平可保護(hù)心肌細(xì)胞免受CVB3[15]。已有研究表明漢黃芩苷可通過(guò)抑制NF-κB蛋白磷酸化以及NLRP3炎癥小體的激活，減弱結(jié)腸炎所致的結(jié)腸組織損傷[10]。漢黃芩苷還可通過(guò)調(diào)控AKT/NF-κB信號(hào)通路抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。本研究結(jié)果表明漢黃芩苷可下調(diào)病毒性心肌炎小鼠心肌組織內(nèi)AKT和NF-κB蛋白磷酸化水平，且給予漢黃芩苷治療組小鼠AKT激動(dòng)劑處理后，漢黃芩苷的抗炎作用會(huì)受到顯著抑制，提示漢黃芩苷可通過(guò)抑制AKT/NF-κB通路改善病毒性心肌炎急性期小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

綜上所述，漢黃芩苷可減少心肌組織內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，下調(diào)血清中和心肌組織中炎癥因子IL-1β和IL-6表達(dá)，同時(shí)抑制心肌組織AKT和NF-κB蛋白的磷酸化。給予AKT激動(dòng)劑處理可消除漢黃芩苷對(duì)病毒性心肌炎小鼠炎癥反應(yīng)的抑制作用。漢黃芩苷可通過(guò)下調(diào)AKT/NF-κB通路抑制病毒性心肌炎小鼠體內(nèi)的炎癥反應(yīng)。該研究結(jié)果可為病毒性心肌炎臨床治療藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。