李 竹， 萬昌武， 于燕妮， 黃 江， 夏 冰， 汪元河， 汪家文， 王 杰

(貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院， 貴州 貴陽 550004)

冠心病(coronary heart disease, CHD)指因冠狀血管病變導(dǎo)致心肌供血不足而引起的缺血性心臟病，是由于冠狀動脈病變導(dǎo)致血管結(jié)構(gòu)性或功能性狹窄，使心肌供血不足，從而引起一系列心臟代謝、功能及結(jié)構(gòu)的紊亂疾病。研究表明，CHD是心血管系統(tǒng)疾病中發(fā)病率最高的疾病，也是導(dǎo)致猝死最常見的疾病，對人類健康及生命構(gòu)成了極大危害[1]。melusin蛋白是一種特異性的肌肉組織蛋白，屬于黏附分子的一員，其具有獨特的結(jié)構(gòu)域，不僅介導(dǎo)了細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)及其細(xì)胞自身的黏附，還參與了細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與活化等重要的生理病理過程(生長、分化、炎癥反應(yīng)及創(chuàng)傷修復(fù)等)[2]。研究表明，melusin在血管平滑肌細(xì)胞特別是在斑塊內(nèi)微血管中存在，對冠狀動脈粥樣硬化中血管的形成具有顯著的調(diào)節(jié)作用[3-4]。動物實驗也證實，在動脈粥樣硬化早期，melusin的高表達(dá)可以引起粥樣斑塊的生長；同時其能幫助平滑肌細(xì)胞浸潤血管內(nèi)膜從而促進新生血管的生成，在動脈粥樣硬化晚期可以防止斑塊破裂、出血[5]。在小鼠的左前降支冠狀動脈結(jié)扎模型中，melusin的表達(dá)發(fā)揮了重要的保護作用，不僅減少了炎癥細(xì)胞的浸潤，還改善了缺血遠(yuǎn)端的冠脈痙攣及心肌組織的缺血狀態(tài)，有效防止了心臟破裂[6-7]。有研究報道，在動脈粥樣硬化患者的心肌中，melusin的蛋白及mRNA表達(dá)量較正常實驗者顯著降低[8-9]。由此可見，melusin作為一種保護性因子，參與了心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生，在冠狀動脈疾病，尤其是冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。但上述研究結(jié)果來源僅限于動物模型、血清學(xué)等層面，關(guān)于直接檢測人體心臟組織中melusin表達(dá)的報道較為罕見。

本研究旨在通過收集法醫(yī)鑒定中冠心病案例，檢測心肌組織中melusin蛋白的表達(dá)水平，分析其在不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下的改變情況，探討melusin表達(dá)與冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為冠心病的早期預(yù)防和治療提供更為充分的實驗依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗材料收集

根據(jù)衛(wèi)生部頒布的《解剖尸體規(guī)則》并獲得了貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的認(rèn)可(倫審批件號：2018-60-01)，提取了貴州醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)司法鑒定中心2014年5月～2018年10月經(jīng)尸體解剖檢驗的人體冠狀動脈及心臟組織樣本，主要為左心室肌實驗組和對照組。實驗組案例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入的案例為常溫保存1 d或冰凍保存3 d以內(nèi)(后于室溫解凍24 h)者；(2)經(jīng)組織病理學(xué)檢查確認(rèn)存在冠心病病變：①冠狀動脈管壁內(nèi)膜增厚、管腔變窄，增厚的冠脈內(nèi)膜見粥樣斑塊形成，存在或不存在繼發(fā)病變(粥樣斑塊破裂、斑塊內(nèi)出血、動脈瘤形成等)；②合并心肌病變(心肌纖維化、心肌梗死等)；(3)冠狀動脈粥樣硬化伴有或不伴有心肌缺血改變；(4)冠心病伴有或無心臟肥大；(5)按WHO規(guī)定，猝死是指從癥狀發(fā)作至死亡時間在24 h內(nèi)。實驗組案例排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)組織自溶、腐敗，結(jié)構(gòu)不清的病例；(2)尸體檢驗及組織病理學(xué)檢查證實有風(fēng)濕性心臟病、心肌病、心肌炎等病變；(3)具有惡病質(zhì)或多器官功能障礙及全身感染性炎癥的病例。對照案例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)納入的案例為常溫保存1 d或冰凍保存3 d以內(nèi)(后于室溫解凍24 h)者；(2)死亡原因明確為意外高墜、機械性窒息死亡或溺死且無冠狀血管及心肌組織病變。排除標(biāo)準(zhǔn)同實驗組。

根據(jù)上述納排標(biāo)準(zhǔn)，對照案例選取無病變的冠狀動脈前降支及左心室??；實驗組選取肉眼所見的冠狀動脈粥樣硬化病變最重(狹窄最重)血管段，經(jīng)組織學(xué)檢查證實為粥樣硬化病變的案例，同時提取案例對應(yīng)的左心室肌組織。所取組織均以4%中性甲醛液固定供HE染色和免疫組織化學(xué)(immunohistochemical staining，IHC)染色，其中部分心肌組織置于-80 ℃冰箱凍存供Western blot及real-time PCR檢測。

2 主要儀器與試劑

兔抗人melusin單克隆抗體(GeneTex)；兔抗人β-actin單克隆抗體(Bioss)；PV9000二步法試劑盒(中杉金橋)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(Thermo)；SYBR? Select Master Mix試劑(Applied Biosystems)。顯微鏡(Olympus)；ND2000 超微量紫外分光光度計和ABI Fast 7500型實時熒光定量PCR儀(Thermo)。

3 主要方法

3.1心肌組織HE染色及形態(tài)觀察 經(jīng)4%中性甲醛液固定的心肌組織，石蠟包埋后行4 μm切片，HE染色后于光鏡下觀察心肌的結(jié)構(gòu)變化，并采集圖像。

3.2Western blot檢測人心肌組織內(nèi)melusin蛋白的表達(dá) 取出-80 ℃冰箱凍存的心肌組織(重量70～90 mg)勻漿，提取蛋白。用紫外分光光度計測量其濃度，以β-actin為內(nèi)參照，行SDS-PAGE分離(12% SDS膠濃度)。PVDF膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉后孵育Ⅰ抗β-actin(1∶2 000)、melusin(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶10 000)Ⅱ抗，經(jīng)過底物顯色后進行圖像采集，采用ImageJ軟件檢測各泳道的灰度值并分析。

3.3IHC染色檢測心肌組織內(nèi)melusin蛋白的表達(dá)與分布 石蠟包埋的4 μm切片，脫蠟，水化，高壓熱修復(fù)抗原，以melusin抗體(1∶150)為Ⅰ抗，以PBS緩沖液為陰性對照，4 ℃孵育過夜。以辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG為Ⅱ抗，室溫孵育40 min，經(jīng)DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染30 s后封片。于鏡下觀察陽性表達(dá)細(xì)胞的位置、強度后在400倍鏡下選取5個視野拍照，測量平均吸光度(陽性表達(dá)吸光度/測量總面積)以反應(yīng)蛋白表達(dá)水平。

3.4real-time PCR測量心肌組織內(nèi)melusin mRNA的表達(dá)量 采用TRIzol試劑提取心肌組織(70～90 mg)的總RNA。用紫外分光光度計對RNA進行定量，并進行逆轉(zhuǎn)錄。后加入熒光Mix試劑和引物在實時熒光定量PCR儀上測量Ct值，用2-ΔΔCt法計算mRNA表達(dá)量。PCR條件為：50 ℃ 2 min；95 ℃ 2 min；95℃ 30 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。解離曲線條件為：95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；95 ℃ 15 s。所得的引物均是在NCBI網(wǎng)站Gene庫中檢索，并按照引物設(shè)計原則設(shè)計，最后由上海生物工程有限公司合成的。引物序列見表1。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

所得數(shù)據(jù)行正態(tài)分布及方差齊性檢驗。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗。利用logistic回歸對各個單變量與CHD的關(guān)系進行單因素分析，得出各個變量對CHD的優(yōu)勢比(odds ratio, OR)和95%可置信區(qū)間(confidence interval, CI)；并采用廣義相加模型評估m(xù)elusin的表達(dá)和CHD的相關(guān)性。數(shù)據(jù)均來自3次獨立實驗結(jié)果。使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 Real-time PCR引物序列

結(jié) 果

1 光鏡下觀察并分組

按納排標(biāo)準(zhǔn)收集冠狀動脈及心肌組織，實驗組各70例，對照組(A組)各20例。光鏡下觀察冠脈內(nèi)膜，以脂質(zhì)壞死核心占斑塊面積的40%為標(biāo)準(zhǔn)[10]，進而根據(jù)斑塊內(nèi)是否存在繼發(fā)病變將實驗案例分為：B組，動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定組；C組，粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定組但無血栓形成、斑塊破裂、斑塊內(nèi)出血等任一種繼發(fā)病變者；D組，斑塊不穩(wěn)定組且伴有上述任一種繼發(fā)病變者。分組依據(jù)見表2。

表2 分組的依據(jù)

In the case of secondary lesions, there is a single lesion or a combination of two or three secondary lesions.

2 病例基本情況

比較各組間基線資料，組間性別、身高、是否飲酒、是否有慢性呼吸系統(tǒng)疾病及慢性肝臟疾病等資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；年齡、是否肥胖、心臟重量、左心室壁厚度、是否吸煙、是否有高血壓及慢性腎臟疾病等資料差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

3 冠狀動脈及心肌結(jié)構(gòu)的病理變化

HE切片光鏡下可見對照組血管壁薄，內(nèi)膜平滑完整；B、C、D組見血管壁偏心性增厚，管腔不同程度狹窄，內(nèi)膜下見纖維帽形成，于壞死核心底部及周邊見泡沫細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤及大量薄壁小血管增生；部分病例出現(xiàn)典型粥樣壞死灶，壞死核心周邊殘留數(shù)量不等的泡沫細(xì)胞等炎癥細(xì)胞，病灶表面纖維帽厚薄不一；病灶內(nèi)還可見斑塊內(nèi)出血，血栓形成等繼發(fā)病變，血管中膜彈性纖維斷裂、平滑肌細(xì)胞受壓萎縮變薄，外膜可見結(jié)締組織增生及少量淋巴細(xì)胞浸潤,見圖1。

表3 案例的基線資料比較

BMI： body mass index.

Figure 1.Microscopic changes in coronary vascular structures (HE staining, ×40). A: control group; B: atherosclerosis but no sudden coronary death; C: sudden coronary death but coronary atherosclerotic lesions without secondary lesions; D： sudden coronary death and coronary atherosclerotic lesions associated with thrombosis.

圖1 冠狀動脈血管結(jié)構(gòu)的顯微改變(HE染色)

HE切片光鏡下可見對照組心室肌細(xì)胞橫紋結(jié)構(gòu)清晰，核橢圓且染色均勻，心肌纖維形態(tài)規(guī)則; B組見部分心肌細(xì)胞體積增大，胞核增大、深染，形態(tài)不規(guī)則；部分心肌細(xì)胞出現(xiàn)萎縮改變，核漿比相對增大，心肌纖維間隙增寬，橫紋模糊不清；C組可見心肌間質(zhì)增寬，圍繞間質(zhì)小血管的心肌出現(xiàn)纖維化改變；D組見部分心肌伴不同程度的脂肪組織浸潤，部分心肌于梗死灶的周邊部出現(xiàn)凝固性壞死，呈網(wǎng)狀分布，心肌細(xì)胞核消失，肌漿均質(zhì)紅染，嗜酸性染色增強，間質(zhì)水腫，心肌纖維部分溶解消失，細(xì)胞間可見散在的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng),見圖2。

Figure 2.Microscopic change in human myocardial tissue (HE staining, ×100).

圖2 人心肌鏡下病理變化(HE染色)

4 心肌組織內(nèi)melusin蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示與對照組相比，B組心肌組織中melusin表達(dá)顯著升高(P<0.05)，C組中melusin水平較對照組比較明顯降低，且D組melusin水平明顯低于C組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The result of Western blot for melusin. Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖3 melusin的Western blot結(jié)果

5 心肌組織melusin的表達(dá)水平

IHC染色結(jié)果表明，對照組心肌細(xì)胞胞漿中有分布均勻的棕黃色著色，B組心肌細(xì)胞中棕黃色著色細(xì)胞顏色增深；C組中棕黃色染色的心肌細(xì)胞數(shù)量明顯減少，著色變淡；而D組的心肌細(xì)胞胞漿中部分未見棕黃色顆粒的陽性表達(dá)，melusin表達(dá)顯著減弱，陽性染色呈點片狀分布，部分心肌可見大片缺染及淡染的情況，見圖4。

用IPP 6.0軟件分析檢測melusin表達(dá)的平均吸光度，與對照組比較，B組陽性表達(dá)明顯增高，C組和D組陽性表達(dá)顯著降低(P<0.05)，見圖4。

6 心肌組織內(nèi)melusin mRNA的表達(dá)

real-time PCR結(jié)果顯示，B組中melusin mRNA的水平與對照組比較有顯著升高(P<0.05)；C組mRNA水平較對照組明顯降低，D組melusin mRNA水平較C組減少(P<0.05)，見圖5。

7 logistic回歸和多元回歸分析

各變量與CHD發(fā)病關(guān)系的回歸分析結(jié)果顯示，年齡、心臟重量、是否肥胖、是否吸煙、是否有高血壓為CHD發(fā)生的危險因素；而melusin的表達(dá)是CHD發(fā)病的保護因素,見表4。在調(diào)整了各變量后，廣義相加模型結(jié)果顯示melusin的表達(dá)與CHD的發(fā)病密切相關(guān)，呈現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)性(OR=0.3； 95% CI: 0.2～0.4；P<0.01)。

Figure 4.Expression of melusin protein in human myocardial tissues (IHC staining,×400). Mean±SD.*P<0.05vsA group;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖4 人心肌組織melusin蛋白表達(dá)的IHC結(jié)果

Figure 5.The melusin mRNA expression in heart tissues. Mean±SD.*P<0.05 A groups;#P<0.05vsB group;△P<0.05vsC group.

圖5 各組melusin mRNA相對表達(dá)量

討 論

研究表明，心源性猝死是法醫(yī)病理猝死案件中最常見的類型[1]，其中冠心病性猝死位居第1位，約占心源性猝死的50%[11]。CHD是指因冠狀血管病變導(dǎo)致心肌供血不足而引起的缺血性心臟病，缺血程度較輕者可沒有明顯不適或僅表現(xiàn)為心絞痛，程度較重者可因發(fā)生心肌梗死而危及生命，缺血程度嚴(yán)重者則會因心臟功能嚴(yán)重紊亂致短時間內(nèi)死亡，即猝死。引起CHD發(fā)作的原因較多，其中以冠狀動脈粥樣硬化最為多見。由于冠脈內(nèi)膜下脂質(zhì)沉積、纖維組織增生及粥樣壞死灶的形成等，使得病變部位血管壁出現(xiàn)不同程度增厚、彈性降低，管腔出現(xiàn)不同程度狹窄等改變，致使心肌供血不足從而引起CHD發(fā)作。

表4 logistic回歸分析結(jié)果

Melusin is the correction factor.MA: mean absorbance.

Melusin蛋白是由基因ITGB1BP2(Xq12～q13) 編碼的一種特異性肌肉組織蛋白，在骨骼肌和心肌中特異性的高表達(dá)。其作為整合素β1的功能性伴侶蛋白和支架蛋白，使細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的變化相互傳導(dǎo)，讓細(xì)胞能夠更好的適應(yīng)環(huán)境變化，從而維持細(xì)胞基本功能，提高生存適應(yīng)性[7]。諸多研究證實，在正常生理條件下，心臟的發(fā)育和基礎(chǔ)功能均不受melusin的影響[12]，但在出現(xiàn)主動脈瓣狹窄、冠狀動脈粥樣硬化、高血壓等病理改變后，其表達(dá)增高可以維持心臟正常的節(jié)律性和收縮性，保持心臟形態(tài)，防止心室擴張并向心力衰竭過渡[13]。在小鼠冠狀動脈粥樣硬化模型中，melusin的存在不僅能減少炎細(xì)胞的浸潤，還可以改善缺血遠(yuǎn)端的冠脈痙攣及心肌的狀態(tài)，防止心臟發(fā)生破裂[6-7]，以上研究表明melusin作為一種保護性因子，參與了心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生，能夠有效的減少心肌細(xì)胞凋亡，維持心臟的正常結(jié)構(gòu)和生理功能，在冠狀動脈疾病，尤其是冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了積極的保護效應(yīng)。

研究表明，melusin的高表達(dá)可以誘導(dǎo)心肌肥大，適度增加左心室壁厚度而不改變收縮功能，并且阻止進一步向擴張型心肌病和心力衰竭過渡，同時也可使遠(yuǎn)端缺血區(qū)域的存活心肌組織缺血情況有所改善[6]。本研究檢測了不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下心肌組織中melusin的表達(dá)改變，發(fā)現(xiàn)在粥樣硬化病變輕、心肌缺血程度較輕者的心肌中，melusin表達(dá)量增加，心肌細(xì)胞呈現(xiàn)出肥大改變。但在粥樣硬化病變、心肌缺血嚴(yán)重的患者心肌中，我們檢測到melusin表達(dá)量顯著降低，甚至消失。同時我們將收集的各變量與CHD發(fā)病關(guān)系進行l(wèi)ogistic回歸分析，得到melusin蛋白在心肌組織中的表達(dá)和CHD發(fā)病呈顯著負(fù)相關(guān)性，這提示melusin作為CHD發(fā)病的一種保護因素，可能通過調(diào)節(jié)某種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如PI3K/AKT及MAPK信號通路等[14-15]，減少了炎癥細(xì)胞的浸潤及纖維化，使心肌細(xì)胞凋亡減少，免受氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)，從而發(fā)揮保護心肌細(xì)胞的作用；而melusin含量的減少可能影響了上述信號通路對心肌組織的保護調(diào)節(jié)作用，進而加速病程的進展。但對其所影響的具體信號通路及機制還有待于進一步探討。

此外，本研究還存在一定的局限性。首先，本研究資料統(tǒng)計屬于回顧性研究，難以追溯缺失的基礎(chǔ)資料，如血脂、血壓、血糖等無法測量[16]，所以無法對這類因素與CHD發(fā)病之間的相關(guān)性作出評估；其次，本研究的樣本量有限，可能存在選擇偏倚。

綜上所述，在不同程度冠狀動脈粥樣硬化病變下心肌組織中melusin的表達(dá)差異顯著，且與冠心病的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，提示melusin可能是冠心病發(fā)生發(fā)展過程中心臟的保護因素。