楊曦艷， 關(guān)曉楠， 趙文淑△， 劉 杰， 趙 亮, 楊 迪

(1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院心臟中心， 2北京市高血壓重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100020)

心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)是指缺血心肌血流恢復(fù)再灌注造成新陳代謝功能障礙以及加重心肌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)性損傷而導(dǎo)致細(xì)胞死亡以及梗死擴(kuò)大[1]，是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)再灌注治療、冠狀動(dòng)脈溶栓以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療過程中發(fā)生的并發(fā)癥[2]，加速了心腦血管疾病的發(fā)生率和死亡率。因此，如何有效減輕MIRI是一個(gè)亟待解決的問題。微小RNA(microRNA，miRNA)被認(rèn)為是心血管疾病的關(guān)鍵調(diào)控因子，包括心肌梗死、心力衰竭、心肌肥厚和心律失常等等[3]。因此，miRNA可能是MIRI的有效治療靶點(diǎn)。已有研究表明miR-214缺乏可導(dǎo)致嚴(yán)重的MIRI，促進(jìn)纖維化進(jìn)程以及心肌細(xì)胞凋亡[4]，因此，miR-214有望成為有效治療MIRI的靶點(diǎn)。miR-214-5p是miR-214從5’端的臂加工而來，可靶向p21活化蛋白激酶4(p21-activated protein kinase 4, PAK4),而PAK4是一類保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過對(duì)下游底物的磷酸化來參與并調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞骨架重構(gòu)以及細(xì)胞凋亡等眾多細(xì)胞重要過程[5]。本項(xiàng)工作應(yīng)用大鼠MIRI模型，探討miR-214-5p 靶向PAK4對(duì)缺血再灌注(ischemia-reperfusion, I/R)大鼠心肌損傷和免疫反應(yīng)的作用。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

36只體重為(200±10) g 的SPF 級(jí)健康雄性 SD 大鼠，購自北京市醫(yī)療器械檢驗(yàn)所，許可證號(hào)：SYXK(京)2015-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在溫度(24±2) ℃ 左右、濕度50% 左右，光照為12/12 h光-暗的動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 主要試劑

心肌細(xì)胞購自ATCC(編號(hào)：ATCC-0006)。miR-214-5p過表達(dá)腺病毒(Ad-miR-214-5p)和對(duì)照腺病毒(Ad-Scramble)購自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)試劑盒購自江萊生物科研試劑有限公司(貨號(hào)：TO1061);丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒購自上海晨易生物科技有限公司(貨號(hào)：1306-06-5);大鼠心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I, cTnI)、肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB,CK-MB)、肌紅蛋白(myoglobin,Mb)、白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、IL-1β和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factr-α, TNF-α) ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司(貨號(hào)：ml003145、ml059533、ml003054、ml102828、ml003057和ml002859);二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒購自上海晶康生物工程有限公司(貨號(hào)：JLC-SJ2508-250T)。

3 主要方法

3.1分組、體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移及MIRI大鼠構(gòu)建[6]將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)、模型組(I/R組)、腺病毒對(duì)照組(Ad-Scramble組)和miR-214-5p過表達(dá)組(Ad-miR-214-5p組)，每組9只；腹腔注射30 mg/kg戊巴比妥麻醉大鼠，在左胸第4和第5肋骨切口，輕輕打開心包以暴露心臟。通過26號(hào)針頭分別將100 μL 的Ad-miR-214-5p(1×109PFU)、Ad Scramble(1×109PFU)或鹽水溶液注入對(duì)應(yīng)各組大鼠左心室前壁6個(gè)不同的位點(diǎn)， 縫合胸腔，讓大鼠恢復(fù)。4 d后，將所有大鼠再次麻醉，重新打開胸腔，使用6-0絲線縫合左前部下行冠狀動(dòng)脈(left anterior descending coronary artery, LAD)，將1.5 mm醫(yī)用乳膠管放置在結(jié)扎線和LAD之間。通過收緊乳膠管周圍的結(jié)扎誘導(dǎo)心肌缺血，在缺血30 min后，取出乳膠管以恢復(fù)冠狀動(dòng)脈循環(huán)。在再灌注后12 h，獲得心臟和血液樣品用于進(jìn)一步分析。假手術(shù)組除LAD未結(jié)扎之外，進(jìn)行相同的程序。

3.2RT-qPCR檢測miR-214表達(dá)水平 用TRIzol法提取總RNA并試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行real-time PCR檢測。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性30 s; 94 ℃變性10 s，64 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)。β-actin作為內(nèi)參照，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)攝影，Quantity One 軟件進(jìn)行掃描分析，計(jì)算采用2-ΔΔCt法。miR-214的上游引物序列為 5’-TGCGGACAGCAGGCACAGAC-3’，下游引物序列為 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’；內(nèi)參照U6的上游引物序列為 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA- 3’,下游引物序列為 5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

3.3HE染色觀察心肌損傷 將組織用甲醛固定后，用乙醇梯度脫水，再用二甲苯透明，用石蠟包埋切片；接著，用二甲苯脫蠟，乙醇至水；然后用蘇木精水溶液染色、乙醇脫水、伊紅染色液染色；乙醇脫水、二甲苯透明，封片觀察。

3.4ELISA檢測心肌損傷標(biāo)志物、炎癥因子及活性氧水平 將樣品加入各反應(yīng)孔，37 ℃反應(yīng)45 min。接著用洗滌液洗滌 4 次，再加入生物素標(biāo)記的抗體，在 37 ℃孵育30 min。洗滌后加辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記的鏈霉親和素混合均勻， 在37 ℃反應(yīng) 30 min，接著加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，檢測結(jié)果。

3.5氧化應(yīng)激的檢測 將心肌組織在冰上研磨制成 10% 組織勻漿裝于離心管，離心取上清液。用考馬斯亮藍(lán)法檢測上清液中蛋白質(zhì)含量，再按試劑盒使用說明操作進(jìn)行SOD和MDA的測定。

3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 加入適量胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞，離心棄上清，收集細(xì)胞，加入195 μL膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC)結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻。200×g離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

3.7靶基因預(yù)測 應(yīng)用基因預(yù)測軟件TargetScan (http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-214-5p的靶基因。

3.8雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測靶向關(guān)系 收集生長至對(duì)數(shù)期的心肌細(xì)胞，鋪于96孔板，每孔約4(103個(gè)細(xì)胞，24 h后，分別轉(zhuǎn)染Ad-Scramble+PAK4 WT、Ad-Scramble+PAK4 MUT、Ad-miR-214-5p+PAK4 WT和Ad-miR-214-5p+PAK4 MUT，根據(jù)雙螢光素酶報(bào)告基因試劑盒說明進(jìn)行測定，用螢火蟲螢光素酶活性和海腎螢光素酶活性比值表示螢光素酶的相對(duì)活性。

3.9Western Blot檢測凋亡標(biāo)志蛋白、PAK4、磷酸化的蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)和磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR)表達(dá) 用RIPA裂解液提取培養(yǎng)3 d的各組大鼠心肌細(xì)胞總蛋白，用BCA試劑盒檢測總蛋白濃度，10% SDS-PAGE分離蛋白后用半干轉(zhuǎn)膜儀轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)至聚偏氟乙烯膜。用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h，隨后加入對(duì)應(yīng)的I抗于4℃封閉過夜，第2天加入對(duì)應(yīng)II抗室溫封閉1 h，最后用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法曝光。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。均數(shù)之間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MIRI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中miR-214表達(dá)下調(diào)

再灌注12 h后， MIRI大鼠心肌細(xì)胞中miR-214表達(dá)較無損傷假手術(shù)組顯著下調(diào)(P<0.01);與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠心肌細(xì)胞中miR-214表達(dá)無明顯變化，Ad-miR-214-5p組大鼠心肌細(xì)胞中miR-214表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The expression level of miR-214 in myocardial cells was detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖1 RT-qPCR檢測各組細(xì)胞中miR-214的表達(dá)水平

2 miR-214-5p過表達(dá)減輕 MIRI引起的心肌組織損傷

Sham組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)致密整齊，心肌纖維完整，無心肌纖維斷裂；I/R組與Ad-Scramble組大鼠心肌組織出現(xiàn)細(xì)胞排列嚴(yán)重紊亂，大量心肌纖維斷裂，細(xì)胞變性壞死嚴(yán)重；Ad-miR-214-5p組大鼠心肌組織出現(xiàn)細(xì)胞排列輕度紊亂，較少心肌纖維斷裂，細(xì)胞變性壞死較輕，見圖2A。與sham組相比，I/R組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達(dá)無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見圖2B。

3 miR-214-5p過表達(dá)減輕MIRI引起的心肌細(xì)胞凋亡

與sham組相比，I/R組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.01),見圖3。

Figure 2.Myocardial injury in rats of each group. A: myocardial injury was observed by HE staining; B: myocardial injury marker protein expression was detected by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖2 各組大鼠心肌損傷情況

Figure 3.Apoptosis detected by flow cytometry. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖3 通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況

與sham組相比，I/R組大鼠Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)，Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠Bcl-2、Bax、caspase-3和caspase-9的表達(dá)無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠Bcl-2表達(dá)顯著上調(diào),Bax、caspase-3和caspase-9表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01),見圖4。

4 miR-214-5p過表達(dá)減輕 MIRI引起的氧化應(yīng)激

與sham組相比，I/R組大鼠SOD活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量顯著增高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠SOD活性和MDA含量無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠SOD活性顯著增高(P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.01),見圖5。

5 miR-214-5p過表達(dá)減輕 MIRI引起的炎癥反應(yīng)

與sham組相比，I/R組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量顯著升高(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α的含量無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠IL-6和IL-1β和TNF-α的含量顯著降低(P<0.01),見圖6。

6 miR-214-5p靶向調(diào)節(jié)PAK4

通過基因軟件篩選出PAK4作為miR-214-5p 的靶基因，miR-214-5p與PAK4的3’-UTR存在結(jié)合位點(diǎn),見圖7A。雙螢光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)顯示，miR-214-5p高表達(dá)明顯抑制了含有野生型PAK4質(zhì)粒的螢光素酶活性，但對(duì)突變型PAK4質(zhì)粒的螢光素酶活性無影響(P<0.01)，見圖7B。通過Western I/R組大鼠PAK4表達(dá)顯著下調(diào)(Pblot檢測PAK4的表達(dá)水平可知：與sham組相比，<0.01)； 與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠PAK4的表達(dá)無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠PAK4表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖7C。

Figure 4.The expression levels of caspase-9, caspase-3, Bax and Bcl-2 detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖4 Western blot檢測caspase-9、caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平

7 miR-214-5p過表達(dá)激活 MIRI大鼠PI13K/Akt/ mTOR通路

與sham組相比，I/R組大鼠p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)；與I/R組相比，Ad-Scramble組大鼠p-Akt和p-mTOR的表達(dá)無顯著變化，Ad-miR-214-5p組大鼠p-Akt和p-mTOR表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)，見圖8。

討 論

miRNA是一類小的非編碼RNA，通過轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控靶基因的表達(dá)是在MIRI中起關(guān)鍵的調(diào)控作用，如miR-17-3p、miR-146b[5-7]等。已有研究表明miR-214缺乏可導(dǎo)致嚴(yán)重的MIRI，增加纖維化進(jìn)程以及心肌細(xì)胞凋亡[8]，因此，預(yù)測作為從miR-214 5’端的臂加工而來的miR-214-5p過表達(dá)能夠改善MIRI，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行相關(guān)研究。

心肌組織損傷程度是MIRI最直觀的衡量指標(biāo)，而CK-MB、Mb和cTnI等是心肌梗死的輔助診斷指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-214-5p過表達(dá)下調(diào)MIRI大鼠CK-MB、Mb和cTnI表達(dá)。而CK-MB、Mb和cTnI高表達(dá)意味著心肌受損程度的加深[9]，這提示miR-214-5p過表達(dá)減輕MIRI。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，miR-214-5p過表達(dá)降低大鼠心肌細(xì)胞凋亡率，上調(diào)Bcl-2，下調(diào)Bax、caspase-3和caspase-9。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，而Bax是與Bcl-2同源的水溶性相關(guān)蛋白，具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，二者都屬于線粒體凋亡途徑的標(biāo)志蛋白[10]。caspase-3和caspase-9是半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶，是廣泛運(yùn)用的凋亡標(biāo)志蛋白，而細(xì)胞凋亡途徑主要有胞外信號(hào)激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡酶激活因子激活caspase和通過線粒體釋放凋亡酶激活因子激活caspase途徑[11]。因此，miR-214-5p過表達(dá)明顯抑制MIRI大鼠心肌細(xì)胞依賴線粒體的凋亡途徑。

Figure 5.Oxidative stress of cardiomyocytes in each group. A: SOD activity; B: MDA content. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖5 各組大鼠心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激情況

缺血時(shí)自由基的產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出自身內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)的清除能力，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]，而活性氧可以引起細(xì)胞的凋亡[13]，從而加劇心肌細(xì)胞的損傷程度。SOD和MDA是氧化應(yīng)激的主要指標(biāo)，已有研究表明MIRI會(huì)引起SOD活性降低,MDA含量增加[14]。本項(xiàng)檢測顯示miR-214-5p過表達(dá)升高M(jìn)IRI大鼠的SOD活性,減少M(fèi)DA含量，說明miR-214-5p過表達(dá)能減輕MIRI大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。同時(shí)，MIRI會(huì)引起炎癥反應(yīng)，而炎癥反應(yīng)會(huì)加重MIRI[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-214-5p過表達(dá)顯著降低MIRI大鼠IL-6，IL-1β和TNF-α的含量，這與已有研究抑制炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的釋放可以減緩MIRI大鼠心肌細(xì)胞損傷結(jié)果相一致[16]，說明miR-214-5p過表達(dá)能夠抑制MIRI引起的炎癥反應(yīng)。

Figure 6.The levels of inflammatory factors IL-6, IL-1β and TNF-α measured by ELISA. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖6 ELISA檢測炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α的含量

Figure 7.miR-214-5p targeted PAK4 and upregulated its expression. A:PAK4was predicted by gene software as a target gene of miR-214-5p; B: targeting relationship was detected by luciferase assay; C: the expression level of PAK4 was detected by Western blotting. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖7 miR-214-5p靶向上調(diào)PAK4

Figure 8.The protein levels of p-Akt and p-mTOR detected by Western blot. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group.

圖8 Western blot檢測p-Akt和p-mTOR的表達(dá)水平

本項(xiàng)實(shí)驗(yàn)通過基因預(yù)測軟件篩選出miR-214-5p與PAK4的3’-UTR存在結(jié)合位點(diǎn)，PAK4是miR-214-5p 的靶基因，且miR-214-5p靶向上調(diào)PAK4的表達(dá)。已有研究表明PAK4過表達(dá)上調(diào)p-Akt和p-mTOR表達(dá)，激活PI3K/Akt/mTOR通路[17]。而PI3K/Akt/mTOR通路是具有調(diào)節(jié)各種重要的細(xì)胞功能，如蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、存活等，其可通過影響下游多種效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著抑制凋亡、促進(jìn)增殖的關(guān)鍵作用[18]。本文通過研究顯示miR-214-5p過表達(dá)能夠明顯上調(diào)p-Akt和p-mTOR表達(dá)，激活PI3K/Akt/mTOR通路，這與已有研究MIRI會(huì)抑制PI3K/Akt/mTOR通路激活相一致[19]。

綜上所述，miR-214-5p過表達(dá)靶向PAK4減輕MIRI，并抑制心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，同時(shí)激活PI3K/Akt/mTOR通路。本實(shí)驗(yàn)為MIRI的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)參考數(shù)據(jù)，但其具體分子機(jī)制尚待深入研究。