韓何丹，佘永新，賀永娟，何亞薈，王猛強(qiáng)，王 淼，王珊珊，鄭鷺飛，曹 振，邵 華，金茂俊，金 芬，王 靜，高麗萍,2,

（1.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023；2.生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，北京 100081）

大麥?zhǔn)堑湫偷母咧参锏鞍?、高維生素、高膳食纖維而低脂肪和低糖的健康食品，其營養(yǎng)特征符合現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)的總體目標(biāo)[1]。大量研究報道大麥含有豐富的直鏈淀粉、膳食纖維、多肽、賴氨酸、β-葡聚糖以及多酚類化合物等諸多對人體健康有益的成分[2]。隨著大眾對大麥產(chǎn)品需求量的增加，其質(zhì)量安全如農(nóng)藥殘留問題也受到了廣泛關(guān)注。唑啉草酯（pinoxaden，PXD）是先正達(dá)開發(fā)的一種新苯基吡唑啉類除草劑，亦屬乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）抑制劑類除草劑。作用機(jī)理為ACC制劑，造成脂肪酸合成受阻，使細(xì)胞生長分裂停止，細(xì)胞膜含脂結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致雜草死亡[3]，能有效防除小麥及大麥田中的1 a生禾本科雜草，尤其對大麥、青稞田野燕麥等禾本科惡性雜草具有近100%的防效[4-5]，且不會對大麥產(chǎn)生藥害[6-7]。炔草酯（clodinafoppropargyl，CP）屬芳氧苯氧丙酸類除草劑，低毒除草劑，對類酯生物合成為乙酰輔敏A羥化酶抑制劑有效抑制作用，迅速在土壤中降解為游離酸苯基和吡啶部分，能夠有效防治麥田等禾本科雜草[8-11]。然而，有研究表明CP過量施藥會對麥苗產(chǎn)生一定的藥害作用，且用量越大，藥害作用越強(qiáng)[12]。解毒喹（cloquintocet-mexyl，CLM）又名解草酯，是除草劑CP對應(yīng)的解毒劑[13-14]，可以加速CP在谷物中的解毒作用，用CLM處理過的CP能與葡萄糖發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，大麥用CLM處理后不僅能增強(qiáng)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性還能提高谷胱甘肽和糖苷結(jié)合物的空泡傳輸活性[15-18]。PXD與CP的復(fù)配制劑的防效明顯高于單劑[19-20]，可更有效防治麥田防除1 a生禾本科雜草，兩者與CLM同時施藥對大麥田雜草具有良好的防效[21-22]。

2010年95%唑啉草酯原藥和5%唑啉·炔草酯乳油兩個產(chǎn)品均在我國獲得正式登記。我國GB 2763—2016《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》規(guī)定：PXD和CP的以體質(zhì)量計算的每日允許攝入量分別為0.3、0.000 3 mg/kg，PXD和 CP小麥中的最大殘留限量均為0.1 mg/kg[22]。由于PXD和CP的低毒性使得兩者在小麥和大麥等禾本科農(nóng)作物種植中得到了廣泛的使用，然而，在我國尚未制定這兩種農(nóng)藥在大麥中的殘留限量。研究表明，高濃度安全劑吡唑解草酯（100～4 000 μmol/L）會抑制小麥幼苗的生長[23]，因此為了保證這兩種農(nóng)藥使用的安全性和安全劑對農(nóng)作物的最小傷害，急需對PXD、CP和CLM進(jìn)行檢測方法的研究。目前，關(guān)于PXD原藥的分析方法已有報道[24]，Vishwakarma等[25]通過高效液相色譜對含雜質(zhì)炔草酯的活性含量和其對映異構(gòu)體進(jìn)行了方法建立和驗證。Shen Zigang等[26]建立了高效液相色譜-紫外檢測法對CLM及CP的含量進(jìn)行測定。然而目前對于同時測定實際樣品特別是農(nóng)產(chǎn)品中的PXD、CP和CLM的高效液相色譜-質(zhì)譜分析方法鮮見報道。本實驗通過樣品前處理條件優(yōu)化，建立同時檢測農(nóng)產(chǎn)品中PXD、CP和CLM殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，該方法靈敏度高、操作簡便，可以作為大麥產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的有效方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西大麥1號、西大麥2號和西大麥3號，產(chǎn)地西藏；黃青1號和甘青6號大麥 甘南州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。

PXD、CP、CLM（純度均為99.0%） 德國Dr. Ehrenstofer公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國Mreda科技公司；甲酸（色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純；實驗用水為Milli-Q超純水；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）吸附劑、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18） 天津博納艾杰爾科技公司；石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-30A HPLC與LCMS-8060 MS/MS聯(lián)用系統(tǒng) 日本 島津公司；IKA-2高速勻漿機(jī) 德國IKA公司；Vortex-Genie 2旋渦混合器 美國Scientific Industries公司；MilliQ純水機(jī) 法國Millipore公司；KQ-500DB 型數(shù)控超聲波發(fā)生器 昆山市超聲儀器有限公司；XS105DU電子天平（0.000 1 g） 瑞士Mettler-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品（10±0.5）mg，分別置于10 mL棕色容量瓶，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成質(zhì)量1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，4 ℃冰箱保存。根據(jù)后續(xù)實驗需要，各取儲備液0.1 mL置于10 mL棕色容量瓶，乙腈稀釋至10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)液。配制好的溶液均避光、4 ℃保存。

1.3.2 大麥粒前處理

1.3.2.1 提取

將大麥篩選除去雜質(zhì)粉碎，準(zhǔn)確稱取1 g大麥樣品置于50 mL離心管中，加入乙腈10 mL，振蕩10 min，5 000 r/min 離心5 min，取上清液于10 mL離心管，待凈化。

1.3.2.2 凈化

將上述10 mL溶液轉(zhuǎn)移至裝有150 mg PSA和200 mg C18粉末的離心管中，振蕩2 min，5 000 r/min離心5 min，取上清液，過0.22 μm濾膜后，供HPLC-MS/MS分析。

1.3.3 HPLC-MS/MS條件[27-28]

HPLC 條件：XBridge-C18色譜柱（2.1 m m× 100 mm，3.5 μm）；柱溫40 ℃；流速0.4 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；流動相：A為超純水（含0.1%甲酸），B為乙腈溶液；洗脫梯度：0～1.5 min，20% B；1.6～3.5 min，20%～80% B；3.6～4 min，80%；4.1～5 min，20%。

M S/M S 條件：電噴霧離子源（electrosprayionization，ESI）；離子源接口電壓：+4.0 kV；多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；電離模式：ESI正離子模式；霧化氣（氮氣）；流速3.0 L/min；干燥氣（氮氣）流速10 L/min；碰撞氣：氬氣；脫溶劑管溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃。

1.3.4 無基質(zhì)外標(biāo)曲線

以乙腈作為溶劑，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線

以陰性大麥樣品提取液（同1.3.2.1、1.3.2.2節(jié)操作）為溶劑，將標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制外標(biāo)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel、SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為±s，Origin 9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理條件優(yōu)化

本研究中采用改進(jìn)的QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）方法對樣品進(jìn)行凈化等前處理[29]。 GCB能夠吸附植物提取劑中的色素和甾醇類物質(zhì)，可去除90%的色素；PSA能與基質(zhì)中的有機(jī)酸、脂肪酸、色素和糖類等極性基質(zhì)成分結(jié)合，從而起到凈化作用；而C18則可有效去除基質(zhì)中的脂肪和蠟質(zhì)等非極性有機(jī)物。本實驗以回收率評價對目標(biāo)分析物的吸附作用。比較GCB、PSA和C18對樣品基質(zhì)的凈化效果，如圖1所示。結(jié)果表明，雖然GCB用量在10～50 mg之間，PXD的回收率滿足定量分析。但GCB對CP和CLM極強(qiáng)的吸附作用。當(dāng)GCB用量大于20 mg時，CP的回收率不足72.15%，CLM甚至更低，當(dāng)GCB用量為10 mg時，其回收率僅有35.6%。因此，GCB使用不能滿足樣品中各分析物的回收定量分析。PSA對CP和CLM具有較高的回收率，CP和CLM的回收率分別在98.56%～103.7%、89.7%～98.44%之間，而其用量50 mg時，PXD回收率降至76.7%。然而，C18則對3 種分析物均有良好的回收率，CP、PXD和CLM的回收率分別在101.2%～109.7%、84.3%～96.8%和83.3%～92.2%之間。綜合考慮凈化效果，本實驗通過正交試驗對PSA和C18復(fù)合凈化效果進(jìn)行選擇，結(jié)果顯示PSA 15 mg+C1850 mg，PSA 20 mg+C1880 mg，PSA 20 mg+C1820 mg凈化1 mL提取液時對三者都具有良好的凈化效果，而且在樣品中獲得了可接受的回收率，PXD、CP和CLM的回收率分別在77.8%～82.1%、95.2%～99%和96.5%～113.2%之間。然而在后續(xù)的操作中，PSA 15 mg+C1850 mg凈化后的基質(zhì)干擾最低。

圖 1 不同凈化劑用量對大麥中CP、PXD和CLM回收率的影響Fig. 1 Recoveries of pinoxaden, clodinafop-propargyl and cloquintocet-mexyl in barely with different amounts of adsorbents

2.2 儀器條件的優(yōu)化

圖 2 PXD、CP和CLM的總離子流圖Fig. 2 Total ion chromatograms of pinoxaden, clodinafop-propargyl and cloquintocet-mexyl

表 1 PXD、CP和CLM的質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Mass spectrometric parameters of pinoxaden, clodinafop-propargyl and cloquintocet-mexyl

在MRM模式下對三者的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化?？疾炝鲃酉嗉状?水體系和乙腈-水體系的分離效果。使用甲醇-水體系作為流動相，三者的保留時間較短，且分離效果差；而乙腈-水體系對三者的分離具有明顯的改善，且其響應(yīng)值都顯著提高。Erin等[30]的研究指出，流動相的pH值可改變目標(biāo)物與雜質(zhì)的保留行為，提高靈敏度。因此，在流動體系中加入0.1%甲酸可改善峰形并有助于離子化。PXD、CP和CLM的總離子流圖見圖2，優(yōu)化后PXD、CP和CLM的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)的評價

目標(biāo)物在色譜柱分離的過程中，標(biāo)本中目標(biāo)分析物以外的其他成分會對分析物的測定產(chǎn)生影響，這些成分會與目標(biāo)離子在霧滴表面發(fā)生離子化過程競爭，其競爭結(jié)果會顯著降低或增強(qiáng)目標(biāo)離子的生成效率[31]，最終影響結(jié)果的精確度和準(zhǔn)確度。

優(yōu)化樣品前處理可以有效消除基質(zhì)效應(yīng)，該實驗對2.1節(jié)中3 種復(fù)合凈化劑進(jìn)行選擇，通過建立添加0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L的溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和3 種凈化劑處理的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，比較純?nèi)軇┲袠?biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度的響應(yīng)值（A）和樣品基質(zhì)中添加相同質(zhì)量濃度農(nóng)藥的響應(yīng)值（B）評價基質(zhì)效應(yīng)，計算公式為：

基質(zhì)效應(yīng)越接近100%，基質(zhì)干擾越弱。表2表明，3 種復(fù)合凈化劑中，經(jīng)（PSA 15 mg、C1850 mg）/mL凈化后的大麥提取液的基質(zhì)干擾最弱。因此，本實驗選擇（PSA 15 mg、C1850 mg）/mL作為最佳復(fù)合凈化劑，使用基質(zhì)匹配外標(biāo)法減弱基質(zhì)效應(yīng)對目標(biāo)分析物的影響。優(yōu)化后，三者的MRM色譜圖如圖3所示。

表 2 3 種復(fù)合凈化劑對大麥中PXD、CP和CLM的基質(zhì)效應(yīng)（n= 5）Table 2 Matrix effects of composite purifiers on pinoxaden, clodinafop-propargyl and cloquintocet-mexyl in barley (n= 5)

圖 3 10 μg/L質(zhì)量濃度分析物的MRM色譜圖Fig. 3 MRM chromatograms of analytes at 10 μg/L

2.4 線性相關(guān)性、檢出限與定量限

由于存在基質(zhì)效應(yīng)，本實驗以陰性大麥樣品提取液作為混合標(biāo)準(zhǔn)液的溶劑，采用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。配制0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100 μg/L基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)液，按照上述給定方法測定，HPLC-MS/MS系統(tǒng)數(shù)據(jù)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)。如表3所示，3 種被檢測物在以上含量范圍內(nèi)，質(zhì)量濃度與其峰面積呈良好的線性關(guān)系，取信噪比為3對應(yīng)的待測物質(zhì)量濃度作為檢出限，該方法PXD、CLM和CP的檢出限分別為0.05、0.05 μg/kg和0.02 μg/kg。

表 3 大麥中3 種分析物的線性相關(guān)性、檢出限與定量限（n= 5）Table 3 Linearities, LODs, and LOQs of three analytes (n= 5)

2.5 準(zhǔn)確度和精密度實驗結(jié)果

表 4 大麥粒中PXD、CP和CLM的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 4 Average recoveries and precision RSD of pinoxaden, clodinafop-propargyl and cloquintocet-mexyl in spiked barley grains

為了評價該方法的準(zhǔn)確度，分別測定大麥中PXD、CP和CLM的加標(biāo)回收率。選擇1.3.2.1節(jié)粉碎過篩后的大麥粉作為基質(zhì)樣品，分別添加3 個水平（低、中、高）3 種物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定3 次，以基質(zhì)標(biāo)為基準(zhǔn)計算回收率。表4顯示，PXD、CP和CLM添加量為50、100、200 μg/kg時，平均回收率范圍分別為76.87%～80.72%，95.07%～99.15%和96.73%～103.55%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.49%～9.01%（n=5）之間，且日內(nèi)和日間精密度分別在2.1%～11.5%和0.9%～6.7%（n=6），均小于15%。提示該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，可用于大麥粒內(nèi)除草劑殘留的測定。

2.6 實際樣品分析結(jié)果

依據(jù)實驗優(yōu)化條件，應(yīng)用本方法對西大麥1號、西大麥2號和西大麥3號及黃青1號和甘青6號大麥等樣品進(jìn)行檢測，每個樣品重復(fù)測定3 次。結(jié)果表明，上述3 類農(nóng)藥均未檢出。

3 結(jié) 論

本研究通過對大麥粒前處理方法、凈化條件及色譜質(zhì)譜分析條件的選擇和優(yōu)化，建立QuEChERS-HPLCMS/MS對大麥粒中PXD、CP和CLM的檢測方法。最終以乙腈作為提取劑，PSA+C18（15 mg+50 mg）/mL凈化提取液，基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量，HPLC-MS/MS同時檢測并分析3 種農(nóng)藥殘留量。該方法分析時間短，基質(zhì)干擾小，檢出限低，回收率高，且具有良好的分離效果，可適用于大麥粒等禾本科植物等樣品PXD、CP和CLM的測定分析。