黃 蓉，張學(xué)亮，韓 爍，周子文，莫喬雅，董明盛，芮 昕，張秋勤，陳曉紅，李 偉

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

益生菌指可改善宿主腸內(nèi)微生態(tài)的平衡，并對(duì)宿主有正面效益的活性微生物，具有增強(qiáng)人體免疫力、降低血清膽固醇、幫助吸收營(yíng)養(yǎng)成分等作用。乳酸菌是人體內(nèi)重要的益生菌，是發(fā)酵糖類產(chǎn)物主要為乳酸的一類無(wú)芽孢[1]、格蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌的總稱，擔(dān)負(fù)著人體多種重要生理功能的調(diào)節(jié)任務(wù)，能夠調(diào)節(jié)機(jī)體胃腸道正常菌群，控制內(nèi)毒素，抑制腸道內(nèi)腐敗菌生長(zhǎng)繁殖和腐敗產(chǎn)物的生成，具有維持人體微生態(tài)平衡的作用。乳酸菌要發(fā)揮其益生功能需定植于腸道中，其胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）及短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）等代謝產(chǎn)物可以幫助其發(fā)揮該功能。EPS是指明串珠菌屬、雙歧桿菌屬、乳桿菌屬、鏈球菌屬等微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞壁外的黏液或莢膜多糖的總稱[2-5]，具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血糖、改善人體胃腸道等多種功能特性[6-7]。SCFA具有較強(qiáng)的維護(hù)腸道功能和形態(tài)的作用，兼具治療作用，可以緩解并治療結(jié)腸炎等多種腸道外殼疾病[8-11]。

在前期研究中從新疆賽里木酸奶中篩選到一株產(chǎn)EPS的瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）MB2-1，它能水解乳蛋白產(chǎn)生很多種生物多肽，有些多肽具有抑制引起高血壓的血管緊張素酶活性的作用而起到降血壓 功效[12-19]。已有研究對(duì)其EPS進(jìn)行了分離純化[20]、結(jié)構(gòu)鑒定以及體外抗氧化能力的測(cè)定[21]。L. helveticusMB2-1源EPS分離純化后可得到3 種純組分，分別為EPS-1、EPS-2、EPS-3，各純組分結(jié)構(gòu)已明確，且已知該EPS具有較強(qiáng)的超氧陰離子自由基清除活性，但目前瑞士乳桿菌MB2-1不同多糖組分對(duì)人體腸道菌群的調(diào)節(jié)作用及其益生機(jī)制尚不明確，因此本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)研究源于瑞士乳桿菌MB2-1的總EPS和EPS-2對(duì)益生菌增殖過(guò)程中的生長(zhǎng)密度、多糖消耗量和SCFA生成量的影響，評(píng)價(jià) L. helveticus MB2-1源EPS的益生功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

瑞士乳桿菌（L. helveticus）MB2-1、德氏乳桿菌保加利亞亞種（L. delbrueckiissp.bulgaricus）WG-1、發(fā)酵乳桿菌（L. fermentum）z-15、植物乳桿菌 （L. plantarum）70810、屎腸球菌（Enterococcus faecium）MN-1、L. delbrueckiissp.bulgaricusSRFM-1、 乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）LZ-R-12、副干酪乳桿菌（L. paracasei）S-NA、L. plantarumB1-6、L. plantarumM7-1、L. plantarum17-1、大腸桿菌（Escherichia coli）K12、E. coli O157均由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離純化提供。

低蛋白乳清粉 荷蘭DV營(yíng)養(yǎng)公司；MD34透析袋（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

80 g/L和120 g/L的低蛋白乳清培養(yǎng)基，108 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫80 1.0 mL，無(wú)水乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三銨2.0 g，K2HPO42.0 g，MgSO4·7H2O 0.58 g，MnSO4·4H2O 0.25 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6，121 ℃滅菌20 min。

測(cè)定微生物生長(zhǎng)狀況的培養(yǎng)基都是以源于 L. helveticus MB2-1的總EPS或EPS-2或葡萄糖為唯一碳源的MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

手提式壓力蒸汽滅菌鍋 上海三申醫(yī)療器械有限公司；AUY120分析天平 日本島津公司；LRH系列生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；SL-N電子 天平 上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司；Air Tech超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰公司；Avanti J-E冷凍離心機(jī) 美國(guó)Bechkman Coulter公司；Hei-VAP Advantage（HL）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國(guó)Heidolph公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國(guó)Agilent科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 L. helveticus MB2-1源EPS的制備

1.3.1.1 菌種活化

活化：活化時(shí)采用質(zhì)量濃度為120 g/L的乳清培養(yǎng)基，從甘油管中接種L. helveticus MB2-1進(jìn)行活化，接種量為體積分?jǐn)?shù)4%，活化2 次，37 ℃恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)12 h。

發(fā)酵液制備：發(fā)酵時(shí)采用質(zhì)量濃度為80 g/L的乳清培養(yǎng)基，接種量4%（V/V），培養(yǎng)24 h得到發(fā)酵液。

1.3.1.2 L. helveticus MB2-1源EPS的提取

將發(fā)酵液離心（15 min，12 000×g，4 ℃），除去菌體和雜質(zhì)；上清液添加質(zhì)量濃度為800 g/L的三氯乙酸至終質(zhì)量濃度40 g/L，靜置4～8 h，離心（15 min，12 000×g，4 ℃）除去沉淀蛋白；上清液中加入無(wú)水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)75%，4 ℃靜置12 h，離心取沉淀，去離子水溶解，離心去沉淀；上清液去離子水透析3 d，每8～10 h換水一次，收集透析液。透析液冷凍干燥得到 L. helveticus MB2-1總EPS，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 L. helveticus MB2-1源EPS的純化

將上述提取的總EPS溶解至質(zhì)量濃度為10 g/L，使用DEAE-Cellulose 52進(jìn)行分級(jí)純化，洗脫液分別為純水、0.10 mol/L NaCl、0.30 mol/L NaCl。收集洗脫液冷凍干燥并儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 L. helveticus MB2-1總EPS和EPS-2體外純培養(yǎng) 10 株益生菌及2 株有害菌1.3.2.1 培養(yǎng)基的配制

分別稱取一定量的上述總EPS和EPS-2純組分置于試管中，無(wú)菌水溶解，0.22 μm過(guò)濾；然后分別取代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖，作為唯一碳源添加到無(wú)菌培養(yǎng)基中，并使最終質(zhì)量濃度為20 g/L。其他按正常配制，作為實(shí)驗(yàn)組。

1.3.2.2 菌種活化

將供試的10 株益生菌及2 株有害菌接種于MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，采用多功能酶標(biāo)儀準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)菌濃度。

1.3.2.3 10 株益生菌及兩株有害菌生長(zhǎng)情況的檢測(cè)

將活化好的益生菌以2%（V/V）的接種量，分別添加到實(shí)驗(yàn)組的無(wú)菌培養(yǎng)基中，混勻后移入無(wú)菌96 孔板中，每孔300 μL，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。間隔一定時(shí)間，采用多功能酶標(biāo)儀準(zhǔn)確測(cè)定發(fā)酵液OD600nm值，連續(xù)測(cè)定48 h，每組3 個(gè)重復(fù)樣本。最后以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600nm為縱坐標(biāo)，繪制微生物生長(zhǎng)曲線，擬合曲線方程，計(jì)算各株菌的最大生長(zhǎng)速率和延滯期。

1.3.3 多糖利用率測(cè)定

在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基中，以2%（V/V）的接種量接種上述微生物，分別取培養(yǎng)時(shí)間為6、12、24、48 h的培養(yǎng)液若干，用去離子水稀釋10 倍，用HPLC分析發(fā)酵過(guò)程中多糖的利用情況。利用率計(jì)算公式如下：

式中：A為培養(yǎng)基中初始多糖含量；B為不同反應(yīng)時(shí)間下培養(yǎng)基中多糖含量。

1.3.4 SCFA生成量測(cè)定

在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基中，以2%（V/V）的接種量接種上述微生物。分別取培養(yǎng)時(shí)間為6、12、24、48 h的培養(yǎng)液若干，用抽濾過(guò)的磷酸二氫鉀稀釋10 倍，用HPLC分析不同發(fā)酵時(shí)間SCFA的變化情況以分析發(fā)酵過(guò)程中SCFA生成量。

HPLC條件：色譜柱：ODS-AQ，溫度22 ℃，波長(zhǎng)217 nm，流動(dòng)相為磷酸二氫鉀，流速0.8 mL/min，停止時(shí)間20 min。洗脫程序?yàn)?～16 min，5%甲醇、95%磷酸二氫鉀；16～20 min，50%甲醇、50%磷酸二氫鉀。二極管陣列檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

以乳酸、甲酸和乙酸為標(biāo)準(zhǔn)品，并繪制其標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用Office Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理和繪圖，應(yīng)用Origin軟件求擬合方程，應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行One-way ANOVA統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 L. helveticus MB2-1源EPS的制備

本實(shí)驗(yàn)采用三氯乙酸法對(duì)去除菌體后的發(fā)酵液進(jìn)行脫蛋白處理，得到的多糖產(chǎn)量為789 mg/L。然后使用DEAE-Cellulose 52進(jìn)行分級(jí)純化，純化后得到3 個(gè)組分，分別是去離子水洗脫的組分EPS-1、0.1 mol/L和0.3 mol/L NaCl溶液洗脫的組分EPS-2和EPS-3；總EPS的回收率為60.24%，其中EPS-1、EPS-2和EPS-3的占比分別為17.38%、77.95%和4.67%，EPS-2在總EPS中的比例遠(yuǎn)高于其他兩種EPS組分，因此本實(shí)驗(yàn)選用總EPS和EPS-2進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步對(duì)EPS組分結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)EPS-1、EPS-2、EPS-3分子質(zhì)量相近，單糖組成相同但比例有所差別，且分支度較高，而且EPS-2中的甘露糖比例最高，遠(yuǎn)高于其他EPS純組分[22]。

2.2 10 株益生菌及兩株有害菌生長(zhǎng)曲線

由圖1可知，不同微生物在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基和以EPS-2為唯一碳源的培養(yǎng)基中均有不同程度的生長(zhǎng)，經(jīng)歷了經(jīng)典的延滯期、指數(shù)生長(zhǎng)期以及穩(wěn)定期。以總EPS和以EPS-2為唯一碳源的培養(yǎng)基中各微生物的生長(zhǎng)情況不同；在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基中0～5 h的活菌數(shù)變化不顯著，超過(guò)5 h活菌數(shù)顯著提高，達(dá)到最大值后進(jìn)入穩(wěn)定期；在以EPS-2為唯一碳源的培養(yǎng)基中0～3 h的活菌數(shù)變化不顯著，超過(guò)3 h活菌數(shù)顯著提高。在兩種培養(yǎng)基中菌體數(shù)提高最顯著的均為E. faecium MN-1。總體而言，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，不同碳源培養(yǎng)基的菌體數(shù)變化趨勢(shì)相似。10 株有益菌在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)較高，2 株有害菌在以EPS-2為唯一碳源的培養(yǎng)基中最大活菌數(shù)較高。說(shuō)明有益菌在總EPS中生長(zhǎng)的效果更好，總EPS在培養(yǎng)過(guò)程中更易被有益菌利用[23]，相較于EPS-2對(duì)兩株有害菌的生長(zhǎng)存在一定的抑制效果。可能的原因是總EPS中除含有EPS-2外，還含有10.47%的EPS-1?；谝延袑?duì)EPS各組分結(jié)構(gòu)的研究[22,24-25]，發(fā)現(xiàn)EPS-1構(gòu)型中β鍵較多，較有利于益生菌的利用。這就意味著，源于L. helveticus MB2-1的總EPS相較于EPS-2可以很好的被益生菌吸收利用且在一定程度上抑制了有害菌的生長(zhǎng)，總EPS能夠更好地對(duì)有益有害菌的生長(zhǎng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，更好的發(fā)揮其免疫功能。

圖 1 總EPS或EPS-2為唯一碳源對(duì)微生物生長(zhǎng)的影響Fig. 1 Growth curves of different microorganisms with EPS and EPS-2 as sole carbon source

圖2 是各微生物的生長(zhǎng)曲線，表1是各微生物生長(zhǎng)曲線擬合方程，表2和表3是由擬合方程計(jì)算出的各微生物在總EPS和EPS-2中的最大比生長(zhǎng)速率和延滯期。最大比生長(zhǎng)速率是指每小時(shí)單位質(zhì)量的菌體所增加的菌體量，延滯期是指微生物處于一個(gè)新的基質(zhì)環(huán)境, 菌體基本不生長(zhǎng)，但體內(nèi)合成代謝活躍，為微生物的大量生長(zhǎng)和繁殖準(zhǔn)備的時(shí)期[26]。計(jì)算方法是由表1中的擬合方程求二階導(dǎo)數(shù)為0時(shí)的時(shí)間t，此時(shí)的t是達(dá)最大比生長(zhǎng)速率的時(shí)間lag，再將t帶入一階導(dǎo)數(shù)方程，此時(shí)的函數(shù)值即為μmax。由表2可以看出，10 種益生菌在總EPS和EPS-2中μmax和lag是不同的，L. plantarumM7-1、L. delbrueckiissp.bulgaricusWG-1、L. plantarum70810和L. plantarum17-1五株菌，在EPS-2中的μmax較總EPS中大，且lag更小；L. fermentumz-15、L. lactisLZ-R-12、L. plantarumB1-6、L. paracaseiS-NA三株菌在總EPS中的μmax較EPS-2中大，但lag較EPS-2中大；L. delbrueckiissp.bulgaricusSRFM-1在EPS-2中μmax較大，但lag較總EPS中大；E. faeciumMN-1在總EPS中μmax較EPS-2中大，且lag較小。10 株益生菌中，除L. delbrueckiissp.bulgaricusSRFM-1和E. faeciumMN-1之外其余8 株益生菌在EPS-2中生長(zhǎng)的延滯期都較在總EPS中生長(zhǎng)的延滯期短，即在總EPS中微生物所需的適應(yīng)時(shí)間和生長(zhǎng)繁殖的準(zhǔn)備時(shí)間更長(zhǎng)。表3中2 株大腸桿菌在總EPS中的延滯期要明顯高于EPS-2中，在總EPS及EPS-2的最大比生長(zhǎng)速率也遠(yuǎn)低于在葡萄糖中的最大比生長(zhǎng)速率。EPS的這種能被益生菌利用，并抑制有害菌生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)作用，證明EPS是一種潛在的益生元。

圖 2 微生物在總EPS和EPS-2中的擬合生長(zhǎng)曲線Fig. 2 Fitting growth curves of different microorganisms with EPS and EPS-2 as sole carbon source

表 1 EPS and EPS-2中各益生菌的擬合生長(zhǎng)方程Table 1 Fitting growth kinetic equations of different microorganisms with EPS and EPS-2 as sole carbon source

表 2 葡萄糖中有害菌的擬合生長(zhǎng)方程Table 2 Fitting growth kinetic equations of different microorganisms in normal glucose culture

表 3 EPS和EPS-2中各益生菌生長(zhǎng)曲線的μmax和lag值Table 3 μmax and lag of different grwoth kinetic equations

2.3 多糖利用情況

圖 3 不同菌種對(duì)多糖利用情況的比較Fig. 3 Comparison of polysaccharide utilization among different strains

由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中多糖含量明顯降低，10 株益生菌對(duì)L. helveticus MB2-1源EPS的利用率不一，但總的變化趨勢(shì)明顯，即隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖含量減少，多糖利用率增加。培養(yǎng)至第48小時(shí)多糖利用率最大的是L. paracasei S-NA，利用率達(dá)到77.74%，培養(yǎng)至第48小時(shí)多糖利用率最小的是L. plantarum 17-1，利用率達(dá)37.03%。說(shuō)明EPS能夠被各微生物充分利用，是各微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的良好碳源，但不同菌株對(duì)于 L. helveticus MB2-1源EPS的利用情況不一，這可能與不同菌株產(chǎn)生的分解胞外多糖化學(xué)鍵的酶種類和數(shù)量不同有關(guān)。

2.4 SCFA生成

圖 4 培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)對(duì)SCFA產(chǎn)量的影響Fig. 4 Time courses of the production of short chain fatty acids by different microorganisms

由圖4可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，不同微生物產(chǎn)生的SCFA量均有不同程度的提高[27]。含量提高最多、變化最明顯的是乳酸，其原因是所研究的微生物都是乳酸菌，其發(fā)酵產(chǎn)物主要為乳酸。其中生成乳酸含量最高的是L. paracasei S-NA，在培養(yǎng)至第48小時(shí)乳酸濃度達(dá)到57.6 mmol/L，較發(fā)酵之初的26.1 mmol/L提高了121.70%，乳酸濃度提高最不明顯的L. fermentum z-15也提高了35.60%，達(dá)到35.4 mmol/L。甲酸變化最明顯的是 L. plantarum 70810，含量從23.4 mmol/L提高到40.8 mmol/L， 提高了74.40%。乙酸變化最明顯的是L. paracasei S-NA，濃度從27.7 mmol/L提高到35.8 mmol/L，提高了29.20%。表明在以總EPS為唯一碳源的培養(yǎng)基中，10 株益生菌均具有良好的生成SCFA的性能。L. helveticus MB2-1源EPS與傳統(tǒng)的益生元菊糖類似，經(jīng)益生菌發(fā)酵能產(chǎn)生大量短鏈脂肪酸，短鏈脂肪酸能夠降低腸道內(nèi)環(huán)境的pH值，具有刺激腸道蠕動(dòng)和較強(qiáng)的維護(hù)腸道功能、形態(tài)的作用，對(duì)大腸桿菌等致病菌的正常生長(zhǎng)可以抑制，兼具治療作用[28-30]。因此L. helveticus MB2-1源EPS通過(guò)促進(jìn)乳酸菌SCFA的生成可以起到良好的益生功能。

3 結(jié) 論

L. helveticus MB2-1不同多糖組分對(duì)乳桿菌增殖過(guò)程中生長(zhǎng)密度的變化、多糖的利用率和SCFA的生成量影響結(jié)果表明，總EPS和EPS-2能夠被10 種益生菌利用，為其提供生長(zhǎng)繁殖的物質(zhì)基礎(chǔ)，并相較于普通碳源培養(yǎng)基一定程度上抑制2 株有害菌的生長(zhǎng)。在以總EPS為唯一碳源條件下，10 種益生菌能夠生成以乳酸為主，包含甲酸和乙酸的SCFA。L. helveticus MB2-1源EPS具有良好的益生功能，且含總EPS的益生功能較EPS-2的益生功能更為顯著，因此在生產(chǎn)應(yīng)用中，未經(jīng)過(guò)純化分離的總EPS的應(yīng)用范圍比分離純化后的純組分更廣，作用效果更好，同時(shí)有效地降低了成本。該研究為今后更深入地研究 L. helveticus MB2-1源EPS及其不同組分在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的機(jī)制提供了參考，同時(shí)也為EPS作為一種既賦予發(fā)酵乳制品特有風(fēng)味和質(zhì)構(gòu)又強(qiáng)化產(chǎn)品益生功能特性的食品添加劑奠定了基礎(chǔ)。