汪吳晶，佟 平，陳紅兵，高金燕

（1.南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047；2.南昌大學(xué)食品學(xué)院，江西 南昌 330047；3.南昌大學(xué)中德聯(lián)合研究院，江西 南昌 330047）

雞蛋含有豐富的蛋白質(zhì)，是人體攝入蛋白質(zhì)的重要來(lái)源之一，在我國(guó)的產(chǎn)量位居世界第一。但我國(guó)雞蛋的主要銷(xiāo)售形式是未經(jīng)過(guò)消毒、分級(jí)、保鮮處理就直接進(jìn)入市場(chǎng)的鮮蛋[1]，我國(guó)蛋制品深加工產(chǎn)業(yè)起步晚，規(guī)模小，但是市場(chǎng)潛力巨大，前景廣闊[2]。

目前，液態(tài)蛋產(chǎn)品主要包括液態(tài)蛋清、蛋黃和全蛋液3 種。在食品生產(chǎn)加工中具有使用方便、產(chǎn)品均一等優(yōu)點(diǎn)，并且可以有效解決運(yùn)輸過(guò)程中蛋殼易破碎等問(wèn)題[3]。但是液態(tài)蛋產(chǎn)品也存在易被污染等風(fēng)險(xiǎn)，因此需要對(duì)其進(jìn)行充分殺菌。常采用巴氏殺菌法對(duì)液態(tài)蛋進(jìn)行殺菌處理[4]，巴氏殺菌的溫度一般在60 ℃左右，該溫度可能會(huì)對(duì)雞蛋中的熱敏性組分產(chǎn)生較大的影響[5]，從而影響雞蛋的起泡性、乳化性等功能性質(zhì)[6]。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)在熱處理過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，而結(jié)構(gòu)變化往往會(huì)影響蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[7]；蛋白質(zhì)相互作用也會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響。為了解蛋清蛋白在熱處理中結(jié)構(gòu)的變化，有必要闡明蛋白質(zhì)分子間的相互作用，然而蛋清含有數(shù)百種蛋白質(zhì)，成分復(fù)雜，多種蛋白質(zhì)的相互作用無(wú)法明確進(jìn)行分析，所以本實(shí)驗(yàn)選擇了蛋清中卵白蛋白和溶菌酶2 種重要蛋白進(jìn)行研究，期待為進(jìn)一步探索提供工作基礎(chǔ)。

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）是蛋清中的主要蛋白質(zhì)，占蛋清蛋白的54%，等電點(diǎn)為4.5，由385 個(gè)氨基酸組成，是一種磷糖球蛋白，分子質(zhì)量為44.5 kDa，包含約3%的糖基組分[8]，被作為一種模式蛋白廣泛用于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)及食物過(guò)敏模型的研究[9]。溶菌酶（lysozyme，Lys）占蛋清蛋白的3.4%，是由129 個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，分子質(zhì)量為14.3 kDa[10]，等電點(diǎn)為10.7，易與其他酸性蛋白發(fā)生靜電作用。卵白蛋白和溶菌酶作為雞蛋蛋白常見(jiàn)過(guò)敏原，加熱能夠改變過(guò)敏原蛋白的結(jié)構(gòu)，暴露或隱藏過(guò)敏原表位，從而使其致敏性發(fā)生變化[11]，所以在加熱以及蛋白質(zhì)相互作用后是否會(huì)對(duì)致敏性產(chǎn)生影響也值得探究。

本研究采用離子交換層析方法分離純化出OVA和Lys，在不同的加熱條件下對(duì)OVA、Lys及OVA-Lys混合物進(jìn)行處理，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)蛋白質(zhì)分子質(zhì)量進(jìn)行表征，用濁度、溶解度對(duì)蛋白質(zhì)物理性質(zhì)進(jìn)行分析，通過(guò)圓二色光譜、紫外光譜、熒光光譜表征熱加工對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的影響，并通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）研究相互作用后的蛋白質(zhì)致敏性的變化。旨在確定不同溫度處理下（25、60、65、70 ℃）OVA和Lys相互作用對(duì)其結(jié)構(gòu)和致敏性的影響，為開(kāi)展后續(xù)工作提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白殼雞蛋 市購(gòu)；牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品 生工生物工程（上海）股份有限公司；HRP標(biāo)記羊抗兔IgG、親和素標(biāo)記的羊抗人IgE二抗 美國(guó)Sigma公司；HRP標(biāo)記的鏈霉親和素 欣博盛生物科技有限公司；抗雞蛋過(guò)敏原Lys兔多克隆抗體 美國(guó)奧維亞系統(tǒng)生物公司；抗雞蛋過(guò)敏原OVA兔多克隆抗體為實(shí)驗(yàn)室自制；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

蛋白垂直電泳儀、Model680酶標(biāo)儀、凝膠成像系統(tǒng) 美國(guó)Bio-Rad公司；恒溫水浴鍋 德國(guó)Kottermann公司；J-810型圓二色光譜儀 日本分光公司；TU-1901紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限公司；F-4500型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 雞蛋主要過(guò)敏原的分離純化及熱加工處理

將雞蛋洗凈后分離蛋清蛋黃并去除系帶，取100 mL蛋清用2 倍Tris-HCl稀釋后，在4 ℃緩慢攪拌3 h，離心除去沉淀后經(jīng)DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱分離卵白蛋白和溶菌酶，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[12]。利用SDS-PAGE對(duì)分離所得的OVA和Lys進(jìn)行分析，如圖1所示。經(jīng)quantity one軟件對(duì)電泳圖進(jìn)行分析，OVA和Lys的純度均達(dá)到98%以上。

圖 1 純化的雞蛋蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of purified egg white proteins

將純化的卵白蛋白和溶菌酶用0.01 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）稀釋?zhuān)孤寻椎鞍椎馁|(zhì)量濃度為1.588 mg/mL，溶菌酶的質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL（蛋清中卵白蛋白-溶菌酶質(zhì)量比為54∶3.4），使終體積為1 mL，以單個(gè)蛋白（卵白蛋白質(zhì)量濃度1.588 mg/mL，溶菌酶0.1 mg/mL）作為對(duì)照。混勻后在60、65、70 ℃水浴加熱10 min后用冰水浴終止反應(yīng)，以25 ℃加熱的蛋白作為對(duì)照。

1.3.2 SDS-PAGE

參考常雪嬌等[13]的方法采用SDS-PAGE對(duì)分離所得蛋白以及熱處理后的蛋白進(jìn)行分析檢測(cè)，樣品與上樣緩沖液1∶1（V/V）混合后，取10 μL加入聚丙烯酰胺凝膠膠孔內(nèi)（采用分離膠12%，濃縮膠5%），電流參數(shù)為12 mA、30 min和24 mA、90 min。電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)顯色、脫色后進(jìn)行凝膠成像。

1.3.3 溶解度和濁度的測(cè)定

采用BCA試劑盒測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)含量，將不同溫度條件處理下的OVA、Lys、OVA-Lys在4 ℃、10 000×g離心20 min后取上清液進(jìn)行測(cè)定[14]。以牛血清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而計(jì)算出蛋白質(zhì)含量，見(jiàn)式（1）：

式中：S為溶解度/%；P1為離心后各溫度條件下上清液中蛋白質(zhì)含量；P0為上清液中蛋白質(zhì)的總量。

濁度測(cè)定參照Wu Li等[15]方法，將不同溫度條件處理下的OVA、Lys、OVA-Lys于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定蛋白溶液的透過(guò)率T（%），并采用超純水作為空白對(duì)照。濁度計(jì)算見(jiàn)式（2）：

1.3.4 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析

1.3.4.1 紫外-可見(jiàn)分光光譜分析

將不同溫度條件處理下的OVA、Lys、OVA-Lys樣品用0.01 mol/L的PBS稀釋至0.1 mg/mL。采用TU-1901雙束紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)分析熱處理前后蛋白質(zhì)復(fù)合物與單體的三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。波長(zhǎng)掃描范圍為250～350 nm，波長(zhǎng)間隔為1.0 nm，光譜帶寬為2.0 nm，光徑為1 cm，響應(yīng)時(shí)間為0.2 s。

1.3.4.2 圓二色光譜分析

采用MOS-450圓二色光譜分析熱處理前后蛋白質(zhì)復(fù)合物與單體的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，樣品質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL。遠(yuǎn)紫外波長(zhǎng)掃描范圍為190～240 nm，掃描速率為100 nm/min，光徑為0.1 cm，帶寬0.1 nm。并通過(guò)網(wǎng)站對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，結(jié)果以平均摩爾橢圓 率（deg·cm2/dmol）表示[16]。線(xiàn)上分析網(wǎng)址為http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk/html/process.shtml。

1.3.4.3 外源性熒光光譜分析

采用ANS熒光探針?lè)?，檢測(cè)不同溫度條件處理下的OVA、Lys、OVA-Lys表面疏水性差異，樣品質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。在4 mL樣品中加入40 μL ANS溶液避光反應(yīng)1 h后檢測(cè)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng)為390 nm，掃描范圍為400～650 nm，掃描速率為1 200 nm/min，狹縫寬度為5.0 nm，光徑為1 cm，響應(yīng)時(shí)間為0.5 s。

1.3.5 競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)蛋白質(zhì)潛在致敏性

參考Meng Xuanyi等[17]的方法采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法監(jiān)測(cè)OVA、Lys、OVA-Lys對(duì)兔多克隆抗體IgG的結(jié)合能力，并做如下改動(dòng)：檢測(cè)Lys對(duì)OVA的免疫原性的影響時(shí)，采用1 μg/mL的未處理的OVA進(jìn)行包被，用不同溫度處理后的OVA、OVA-Lys作為競(jìng)爭(zhēng)蛋白，一抗使用卵白蛋白致敏的兔血清（1∶20 000，V/V），二抗使用HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶5 000，V/V）；檢測(cè)OVA對(duì)Lys的免疫原性的影響時(shí)，Lys的包被質(zhì)量濃度為20 μg/mL，用不同溫度處理后的Lys、OVA-Lys作為競(jìng)爭(zhēng)蛋白，一抗使用溶菌酶致敏的兔血清（1∶5 000，V/V），二抗使用HRP標(biāo)記羊抗兔IgG（1∶5 000，V/V），并通過(guò)式（3）進(jìn)行計(jì)算：

式中：B為有競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值；B0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值。

采用競(jìng)爭(zhēng)抑制ELISA方法對(duì)不同溫度處理后的OVA、Lys、OVA-Lys的致敏原性進(jìn)行評(píng)估。檢測(cè)Lys對(duì)OVA致敏原性的影響時(shí)，采用3.2 μg/mL的OVA進(jìn)行包被，用不同溫度處理后的OVA、Lys、OVA-Lys作為競(jìng)爭(zhēng)蛋白，過(guò)敏患者血清池（一抗）的稀釋倍數(shù)為 1∶2 0（V/V），二抗使用生物素標(biāo)記的羊抗人I g E（1∶5 000）；檢測(cè)OVA對(duì)Lys的致敏原性的影響時(shí)，采用1 μg/mL的Lys進(jìn)行包被，用不同溫度處理后的OVA、Lys、OVA-Lys作為競(jìng)爭(zhēng)蛋白。并通過(guò)式（4）進(jìn)行計(jì)算：

式中：B為有競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值；B0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)蛋白對(duì)應(yīng)的OD值。

當(dāng)包被蛋白相同時(shí)，測(cè)得的OD值越大表明競(jìng)爭(zhēng)蛋白殘余的IgE結(jié)合量越多，即競(jìng)爭(zhēng)蛋白的抗原性越弱，所以B0-B數(shù)值越大，表明競(jìng)爭(zhēng)蛋白的結(jié)合能力越強(qiáng)。以此評(píng)估OVA、Lys、OVA-Lys三者的致敏原性。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin Pro 9.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖；并采用IBM SPSS Statistics 22.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，P＜0.05，差顯著異。

2 結(jié)果與分析

2.1 OVA、Lys、OVA-Lys的溶解度和濁度變化

利用BCA試劑盒對(duì)不同溫度處理下的OVA、Lys、OVA-Lys的溶解度進(jìn)行分析，如圖2A所示。OVA在70 ℃加熱后溶解度有顯著性降低，但仍在90%以上，可能形成了極少量不溶性聚合物，在60、65 ℃加熱下溶解度無(wú)顯著性變化。Lys單體在60、65 ℃與常溫相比溶解度無(wú)顯著性變化，說(shuō)明較低溫度加熱沒(méi)有使溶菌酶產(chǎn)生不溶性聚合物，而70 ℃加熱后溶解度顯著性降低，熱處理可以引起蛋白分子結(jié)構(gòu)的展開(kāi)同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致分子表面帶電氨基酸重新排布，使蛋白表面電荷發(fā)生改變，對(duì)親水性/疏水性平衡產(chǎn)生影響，從而導(dǎo)致溶解性降低[18]。 OVA-Lys在60、65 ℃混合加熱后溶解度有下降的趨勢(shì)，但與單體加熱相比溶解度未呈現(xiàn)顯著性變化，說(shuō)明OVA和Lys混合物加熱溶解度下降的主要原因是受溫度影響，但在70 ℃溶解度與單體相比顯著降低，降為84%，說(shuō)明在70 ℃條件下OVA和Lys會(huì)形成部分不溶性聚合物。

對(duì)不同溫度處理下的OVA、Lys、OVA-Lys的渾濁程度進(jìn)行分析，如圖2B所示。OVA和Lys單體隨著溫度的升高濁度呈上升趨勢(shì)，且在70 ℃加熱與常溫相比均有顯著性變化，說(shuō)明70 ℃加熱能使其形成了少量聚合物。OVA-Lys在60、65 ℃條件下混合加熱后濁度有上升的趨勢(shì)，但與單體加熱相比濁度未呈現(xiàn)顯著性變化，說(shuō)明OVA和Lys混合物加熱濁度上升主要是受溫度影響，而兩者并未發(fā)生明顯的作用使渾濁程度增大。但在70 ℃條件下濁度與單體相比顯著升高，說(shuō)明在此溫度下OVA和Lys能相互作用形成了大分子聚合物。濁度和溶解度的變化可以初步判斷OVA和Lys能在70 ℃條件下發(fā)生較明顯的相互作用導(dǎo)致物理性質(zhì)的改變。且對(duì)比濁度變化結(jié)果，隨著濁度的上升，可溶性蛋白含量下降，說(shuō)明在熱處理過(guò)程中蛋白質(zhì)溶液中由于不溶性沉淀的形成可以造成蛋白溶液濁度的上升[19]。

圖 2 不同溫度下蛋白質(zhì)的溶解度（A）和濁度（B）變化Fig. 2 Soluble protein concentration (A) and turbidity (B) of protein solutions heated at different temperatures

2.2 OVA、Lys、OVA-Lys的還原型和非還原型SDS-PAGE

利用還原型和非還原型SDS-PAGE對(duì)不同溫度處理下的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分析如圖3所示。對(duì)于OVA單體而言，非還原狀態(tài)下有較多的OVA的二聚體，在還原狀態(tài)下二聚體基本消失，說(shuō)明OVA可以通過(guò)二硫鍵結(jié)合形成二聚體，而溫度對(duì)卵白蛋白單體的影響不大。對(duì)于Lys單體而言，在各溫度下還原和非還原條帶類(lèi)似，說(shuō)明溫度對(duì)其分子質(zhì)量影響不大。對(duì)于OVA-Lys的混合物而言，25、60、65 ℃條件下的蛋白樣品條帶基本一致，且是單體OVA和單體Lys條帶的疊加，但在70 ℃條件下，非還原型SDS-PAGE中的Lys條帶消失，且泳道口有少量聚集物，而在還原型電泳中Lys條帶仍然清晰可見(jiàn)，說(shuō)明在70 ℃時(shí)Lys會(huì)與OVA結(jié)合，并且是通過(guò)二硫鍵結(jié)合。

圖 3 蛋白質(zhì)的還原型和非還原型SDS-PAGEFig. 3 SDS-PAGE analysis of reduced and non-reduced proteins

2.3 OVA、Lys、OVA-Lys的結(jié)構(gòu)分析

蛋白質(zhì)產(chǎn)生紫外吸收光譜主要是由于色氨酸和酪氨酸殘基側(cè)鏈對(duì)紫外光的吸收，其次是苯丙氨酸、組氨酸和半胱氨酸殘基側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)紫外光的吸收[20]，通過(guò)對(duì)紫 外-可見(jiàn)光譜的測(cè)定可以反映蛋白質(zhì)的芳香族氨基酸極性是否發(fā)生改變。對(duì)不同溫度處理下的OVA、Lys、OVA-Lys 的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析如圖4所示。OVA在25、60、65 ℃條件下圖譜基本相同，說(shuō)明在此溫度下卵白蛋白單獨(dú)加熱三級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，而在70 ℃條件下最大吸收光譜明顯增大，說(shuō)明在70 ℃條件下蛋白質(zhì)展開(kāi)程度變大。Lys在25、60、65、70 ℃條件下圖譜基本相同，說(shuō)明在此溫度下Lys單獨(dú)加熱三級(jí)結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化。OVA-Lys混合物在25、60、65 ℃條件下的圖譜基本一致，說(shuō)明OVA-Lys混合物在此溫度下結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，但在70 ℃條件下加熱10 min后圖譜有輕微的藍(lán)移，說(shuō)明OVA-Lys的芳香族氨基酸殘基的微環(huán)境極性發(fā)生改變，藍(lán)移說(shuō)明殘基移向親水的環(huán)境[21]；另一方面OVA-Lys 的最大吸收峰較單體而言明顯增強(qiáng)，可能是由于OVA和Lys在70 ℃相互作用后蛋白的展開(kāi)程度進(jìn)一步變大，從而導(dǎo)致色氨酸和酪氨酸殘基暴露在蛋白質(zhì)分子表面[22]。

圖 4 不同溫度處理下蛋白質(zhì)的紫外-可見(jiàn)光譜Fig. 4 UV absorption spectra of protein solutions heated at different temperatures

在190 nm波長(zhǎng)附近有一個(gè)正峰，222、208 nm波長(zhǎng)處呈負(fù)峰，是典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)；在185～200 nm波長(zhǎng)處有一強(qiáng)的正峰，216 nm波長(zhǎng)處有一個(gè)負(fù)峰，是β-折疊的結(jié)構(gòu)[22]。由圖5可知，OVA和Lys都具有典型的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)。對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，與未加熱OVA 相比，60、65、70 ℃加熱后的OVA β-轉(zhuǎn)角均有顯著性提高，但只有在70 ℃加熱的OVA無(wú)規(guī)卷曲含量顯著增大，說(shuō)明70 ℃條件下OVA分子逐漸由有序變得無(wú)序。與未加熱Lys 相比，70 ℃加熱后的Lys無(wú)規(guī)卷曲含量顯著增大，說(shuō)明Lys分子在70 ℃條件下由有序變得無(wú)序，而其他溫度下無(wú)明顯變化。OVA-Lys在加熱后α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角含量無(wú)顯著性變化，但在70 ℃無(wú)規(guī)卷曲程度變大，說(shuō)明在70 ℃條件下分子向無(wú)序方向發(fā)展。

圖 5 不同溫度處理下蛋白質(zhì)的圓二色光譜圖Fig. 5 CD spectra of protein solutions heated at different temperatures

疏水基團(tuán)的相互作用是維持蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)最重要的作用力之一，ANS與蛋白質(zhì)結(jié)合的熒光強(qiáng)度與蛋白質(zhì)的表面疏水性呈正相關(guān)[7]，利用外源性熒光光譜對(duì)不同溫度處理下的OVA、Lys、OVA-Lys的疏水性進(jìn)行分析如圖6所示。OVA單體隨著溫度的變化其熒光強(qiáng)度變化不大只有輕微上升。Lys單體隨著溫度的升高，熒光強(qiáng)度少量增加，且在70 ℃條件下熒光強(qiáng)度最大，說(shuō)明其隨著溫度升高疏水性變大，且70 ℃條件下疏水性最大。OVA-Lys混合物在60 ℃條件下熒光強(qiáng)度無(wú)明顯變化，65 ℃加熱后熒光強(qiáng)度有少量增加，70 ℃條件下熒光強(qiáng)度增加幅度較大，說(shuō)明OVA-Lys在65、70 ℃加熱后疏水性增大。但OVA-Lys在65 ℃條件下與單體的形狀類(lèi)似，而70 ℃條件下OVA-Lys熒光強(qiáng)度較單體有較明顯的上升，說(shuō)明OVALys在65 ℃條件下熒光強(qiáng)度變大可能只是因?yàn)闇囟鹊挠绊?，?0 ℃條件下OVA-Lys熒光強(qiáng)度上升不僅受到溫度的影響，同時(shí)兩者能相互作用促使疏水基團(tuán)暴露。

圖 6 不同溫度處理下蛋白質(zhì)的外源性熒光光譜Fig. 6 ANS Fluorescence spectra of protein solutions heated at different temperatures

2.4 OVA、Lys、OVA-Lys的免疫原性

利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)不同溫度處理下的OVA、Lys對(duì)OVA、Lys、OVA對(duì)Lys的免疫原性進(jìn)行分析如圖7所示。OVA、Lys單體隨著溫度的升高免疫原性顯著降低，說(shuō)明加熱能破壞OVA、Lys的IgG結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)于復(fù)合物而言，隨著溫度的升高OVA-Lys的免疫原性有顯著性降低，且溫度越高復(fù)合物的免疫原性越低，但由圖7A可知，60、65 ℃條件下OVA-Lys復(fù)合物與OVA單體相比，其免疫原性并沒(méi)有顯著降低（P＞0.05），說(shuō)明在60、65 ℃條件下OVA與Lys相互作用后并沒(méi)有降低OVA的免疫原性。在70 ℃條件下OVA-Lys復(fù)合物較OVA單體而言，其免疫原性顯著降低（P＞0.05），說(shuō)明OVA與Lys在70 ℃條件下相互作用可以降低OVA的免疫原性。類(lèi)似地，由圖7B可知，60、65 ℃條件下OVA與Lys相互作用后也沒(méi)有降低Lys的免疫原性，70 ℃條件下OVA與Lys相互作用可以降低Lys的免疫原性，說(shuō)明OVA和Lys在70 ℃相互作用后能相互影響蛋白的免疫原性，說(shuō)明其相互作用的位點(diǎn)可能在IgG結(jié)合位點(diǎn)上。

圖 7 不同溫度處理下蛋白質(zhì)的免疫原性Fig. 7 IgG Binding ability of protein solutions heated at different temperatures

2.5 OVA、Lys、OVA-Lys的致敏原性

利用競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)不同溫度處理下的OVA單體、Lys單體、OVA-Lys的致敏原性進(jìn)行分析，結(jié)果如圖8所示。圖8A顯示，OVA單體在70 ℃加熱10 min后致敏原性顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明70 ℃加熱能破壞OVA的IgE結(jié)合位點(diǎn)，而60、65 ℃對(duì)OVA的致敏原性沒(méi)有顯著影響 （P＞0.05）。圖8B顯示，Lys單體在加熱的情況下致敏原性無(wú)明顯變化，說(shuō)明加熱并沒(méi)有顯著影響Lys的致敏原性（P＞0.05）。與25 ℃相比較，由圖8C、D可知，65、70 ℃條件下OVA-Lys復(fù)合物的致敏原性呈下降趨勢(shì)，說(shuō)明較高溫度熱處理能降低OVA-Lys的致敏原性；60、65 ℃條件下OVA-Lys復(fù)合物與單體相比，其致敏原性并沒(méi)有顯著降低，說(shuō)明在此溫度下OVA與Lys相互作用后并沒(méi)有降低OVA或Lys的致敏原性。但在70 ℃條件下，與單體相比，OVA-Lys復(fù)合物的致敏原性顯著降低，說(shuō)明OVA與Lys在70 ℃條件下相互作用可以影響對(duì)方的潛在致敏性。

圖 8 不同溫度處理下蛋白質(zhì)的致敏原性Fig. 8 IgE binding ability of protein solutions heated at different temperatures

3 討 論

溶菌酶等電點(diǎn)為10.7，含有4 個(gè)二硫鍵。因此，它易與其他酸性蛋白質(zhì)發(fā)生靜電作用，如卵白蛋白[23]、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白[24]等。卵白蛋白是蛋清中的主要蛋白質(zhì)，等電點(diǎn)為4.5，含有1 個(gè)二硫鍵和4 個(gè)自由巰基，二硫鍵位于Cys 73和Cys 120之間，自由巰基均位于蛋白質(zhì)分子的內(nèi)部疏水核心中[25]，Iwashita等[26]表明加熱后的OVA能使自由巰基暴露，從而與Lys通過(guò)可逆的非共價(jià)鍵以及不可逆的二硫鍵進(jìn)行結(jié)合，但未從結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行深入的解釋。本研究從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面對(duì)OVA和Lys相互作用進(jìn)行了分析，結(jié)果表明70 ℃熱處理可以導(dǎo)致OVA三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，無(wú)規(guī)卷曲程度變大，分子由有序結(jié)構(gòu)向無(wú)序方向發(fā)展，從而導(dǎo)致OVA和Lys之間的巰基相互反應(yīng)產(chǎn)生二硫鍵，形成不溶性聚合物，導(dǎo)致溶液變渾濁，而且還原型和非還原型電泳圖也證明了該結(jié)果。因此，OVA和Lys在70 ℃條件下能通過(guò)二硫鍵相互作用。在60、65 ℃條件處理下，OVA和Lys的三級(jí)結(jié)構(gòu)并沒(méi)有展開(kāi)，只有輕微的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。因此，無(wú)法通過(guò)二硫鍵進(jìn)行結(jié)合。另一方面，由于在生理pH值下，Lys帶正電荷，而OVA帶負(fù)電荷，所以?xún)烧呖梢宰园l(fā)地通過(guò)靜電相互作用進(jìn)行反應(yīng)[27]，且溫度越高，反應(yīng)程度越大。所以O(shè)VA和Lys能在70 ℃發(fā)生顯著的相互作用主要是因?yàn)镺VA在70 ℃條件下結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，從而會(huì)與Lys通過(guò)靜電相互作用以及二硫鍵相互作用進(jìn)行結(jié)合。

Golias等[28]已證實(shí)70 ℃條件下加熱可以引起OVA的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，能夠改變其消化性和抗原表位的構(gòu)象，最終導(dǎo)致其致敏性的降低。Jiménez-Saiz等[29]模擬巴氏滅菌條件，在65 ℃對(duì)OVA加熱30 min，結(jié)果表明，熱處理可以降低OVA與過(guò)敏患者血清致敏原性以及和兔血清免疫原性。本研究在25、60、65、70 ℃對(duì)蛋白質(zhì)水浴加熱10 min，選取10 min進(jìn)行處理主要是因?yàn)楦鲊?guó)對(duì)蛋清巴氏殺菌的時(shí)間并沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，而10 min完全滿(mǎn)足巴氏殺菌的要求。研究發(fā)現(xiàn)OVA在60 ℃和65 ℃加熱條件下致敏原性并沒(méi)有明顯變化，可能是因?yàn)樵谳^低的溫度以及較短時(shí)間內(nèi)OVA結(jié)構(gòu)并沒(méi)有展開(kāi)，抗原性沒(méi)有明顯變化；而70 ℃條件下分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，可能使部分過(guò)敏原表位被掩埋或破壞，所以致敏性有所降低。吳慶櫟等[30]研究發(fā)現(xiàn)，加熱溫度超過(guò)110 ℃時(shí)，Lys的IgE的結(jié)合能力顯著降低，蛋白的免疫原性降低，在100 ℃以下加熱對(duì)Lys的致敏原性影響不大，該結(jié)果與本研究結(jié)果類(lèi)似。而Lys在熱加工處理后免疫原性有所降低，說(shuō)明隨著Lys疏水基團(tuán)的暴露，其IgG結(jié)合位點(diǎn)可能被掩埋或被破壞。而致敏原性并沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明其在疏水基團(tuán)暴露的情況下IgE結(jié)合位點(diǎn)可能并沒(méi)有暴露、掩埋或破壞。

OVA單獨(dú)加熱時(shí)，70 ℃條件下無(wú)規(guī)卷曲程度變大，三級(jí)結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，免疫原性降低，潛在致敏性降低，而在60、65 ℃條件下變化不大。Lys單獨(dú)加熱時(shí)，隨著溫度的升高無(wú)規(guī)卷曲程度變大，且疏水基團(tuán)有所暴露，免疫原性隨著溫度升高而降低，但潛在致敏性無(wú)明顯變化。OVA在70 ℃條件下結(jié)構(gòu)展開(kāi)，疏水基團(tuán)暴露，從而會(huì)與Lys通過(guò)靜電相互作用以及二硫鍵相互作用進(jìn)行結(jié)合，使其濁度顯著增加，溶解度顯著降低。而且在70 ℃條件下由于OVA和Lys相互作用可以使OVA的免疫原性和致敏原性顯著降低，同時(shí)也能使Lys的免疫原性和致敏原性顯著降低，說(shuō)明兩者在70 ℃條件下能相互作用的位點(diǎn)可能在致敏表位上，從而使蛋白質(zhì)的潛在致敏性得到有效的降低。而60、65 ℃條件下兩者相互作用不明顯。

4 結(jié) 論

OVA-Lys在60、65 ℃條件下加熱10 min后不會(huì)顯著影響彼此的結(jié)構(gòu)以及潛在致敏性，而在70 ℃條件下，由于OVA的三級(jí)結(jié)構(gòu)的展開(kāi)，Lys疏水基團(tuán)的暴露，兩者會(huì)通過(guò)二硫鍵相互作用從而顯著降低彼此的潛在致敏性。蛋清蛋白質(zhì)的相互作用會(huì)影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而對(duì)蛋白質(zhì)的致敏性產(chǎn)生影響，而結(jié)構(gòu)的變化也會(huì)影響到蛋白質(zhì)的其他功能性質(zhì)，所以通過(guò)了解蛋清中主要蛋白質(zhì)的相互作用可以為蛋清蛋白在熱處理過(guò)程中功能性質(zhì)的變化提供一定的理論基礎(chǔ)。未來(lái)也將進(jìn)一步關(guān)注蛋清蛋白的其他組合，從而更詳細(xì)地了解在巴氏殺菌過(guò)程以及其他熱加工過(guò)程中蛋白質(zhì)系統(tǒng)的品質(zhì)變化。