(廣州中醫(yī)藥大學(xué),廣東廣州 510006)

高尿酸血癥(Hyperuricemia,HUA)是由于嘌呤代謝異?；蚰蛩崤判箿p少所引起的代謝性疾病,以血尿酸升高為主要特征[1-2]。尿酸(Uric acid,UA)是人體嘌呤核苷酸代謝的終產(chǎn)物,主要經(jīng)肝臟中廣泛分布的黃嘌呤氧化酶(XOD)催化合成,再經(jīng)腎臟排泄[3]。研究表明,長期的高尿酸癥狀對(duì)血管、心臟、肝臟、腎臟均會(huì)產(chǎn)生一定的損害,與高血壓病、高脂血癥、肥胖及胰島素抵抗等代謝綜合征的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)[4-6],故高尿酸血癥已成為威脅人類健康的重要疾病之一,且隨著人們生活水平的提高和膳食模式的改變,高尿酸血癥的發(fā)病率日益增高。目前臨床上治療高尿酸血癥主要是通過增加尿酸排泄或抑制XOD 活性,最常用的藥物主要有別嘌呤醇(Allopurinol)等XOD抑制劑,其通過治療尿酸過量以降低尿酸水平,但服用別嘌呤醇的患者只有不到40%可將血清尿酸濃度降低至目標(biāo)水平,且長期服用會(huì)導(dǎo)致肝腎損害[7-8]、過敏、骨髓抑制、胃腸道反應(yīng)等[9-11],在一定程度上限制了臨床應(yīng)用。而中醫(yī)藥治療高尿酸血癥經(jīng)驗(yàn)豐富,療效可靠,對(duì)人體副作用小[12-14]。因此,尋找替代或增效的藥物,中藥可能是今后降尿酸研究的方向。

姜黃素是一種天然的疏水多酚,來源于姜黃的根狀莖,一直被作為調(diào)味品及食品添加劑而為大眾熟知,目前發(fā)現(xiàn)其具有多種藥理作用,尤其是在抗炎、抗氧化及促進(jìn)傷口愈合等方面,在抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激方面已得到廣泛的應(yīng)用。有研究表明,姜黃素可通過下調(diào)TGF-β1和NF-κB的表達(dá)發(fā)揮腎臟保護(hù)作用;通過抑制果糖造模的HUA小鼠JAK-STAT的激活及TGF-β1的過表達(dá),上調(diào)腎臟NO水平,起到改善腎臟內(nèi)皮功能障礙和提高尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白能力的作用及抑制尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)體,促進(jìn)UA排泄等作用[15]。但目前關(guān)于姜黃素的降尿酸、抗炎作用尚未充分挖掘和利用,本研究擬通過氧嗪酸鉀誘導(dǎo)建立小鼠高尿酸血癥模型,通過測定小鼠血清中UA及XOD、AST及ALT、CRE及BUN的變化,探討姜黃素對(duì)高尿酸血癥小鼠降尿酸以及其對(duì)肝腎的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雄性昆明種小鼠(體重18～22 g) 廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào):SYXK(粵)2018-0085),動(dòng)物飼養(yǎng)在特定的無特殊病原體(SPF)的條件下,溫度維持在20～25 ℃,每日12 h光照,相對(duì)濕度50%～80%,普通飼養(yǎng);姜黃素(>98%)、氧嗪酸鉀(97%)、別嘌呤醇 美國Sigma化學(xué)公司;尿酸、黃嘌呤氧化酶(XOD)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)移酶(ALT)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1510全波長酶標(biāo)儀、Fresco 70冷凍高速離心機(jī) 德國Thermo Fisher公司;RB-200智能熱板儀 成都泰盟軟件公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

1.2.1.1 熱刺激法-熱板刺激法制備小鼠疼痛模型 選取預(yù)實(shí)驗(yàn)痛閾值符合實(shí)驗(yàn)要求(5～30) s的30只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為5組,每組6只。根據(jù)人體推薦藥物劑量范圍確定姜黃素給藥劑量分為空白組、姜黃素四個(gè)劑量組A1(170 mg·kg-1)、A2(85 mg·kg-1)、A3(42.5 mg·kg-1)、A4(21.3 mg·kg-1)。姜黃素以超微粉顆粒經(jīng)由加熱超聲溶解達(dá)到水中均相?？瞻捉M給予蒸餾水(0.1 mL/10 g),其它各組每天給藥1次,連續(xù)灌胃5 d。各組小鼠給藥前測定基礎(chǔ)痛閾值,待智能熱板儀調(diào)至(55±0.1) ℃后,將小鼠放入鉛罐中,觀察其開始出現(xiàn)舐后足的時(shí)間,則該時(shí)間為小鼠的熱痛反應(yīng)時(shí)間,即痛閾值。在末次給藥2 h后再次測定各組給藥后痛閾值。通過比較姜黃素各劑量組給藥前后小鼠痛閾值的變化,確定姜黃素的鎮(zhèn)痛最佳劑量[16]。

1.2.1.2 化學(xué)刺激法-醋酸刺激法制備小鼠疼痛模型 分組同1.2.1.1,末次給藥2 h后腹腔注射0.6% 醋酸(0.15 mL·10 g-1)。記錄小鼠20 min內(nèi)的扭體次數(shù)和開始出現(xiàn)扭體的時(shí)間。根據(jù)扭體次數(shù)的多少,確定姜黃素鎮(zhèn)痛作用的強(qiáng)弱及最佳劑量[17-18]。

1.2.2 姜黃素對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠的作用

1.2.2.1 小鼠高尿酸血癥模型建立與給藥 選取48只小鼠,適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后,隨機(jī)分為4組,分別為空白組、模型組、別嘌醇陽性組(allopurinol,APL,5 mg·kg-1)、姜黃素組(85 mg·kg-1),每組12只。給予普通飼料、純水,自由飲食。其中模型組、別嘌醇陽性組、姜黃素組以氧嗪酸鉀(PO)300 mg·kg-1(i.p)建立高尿酸血癥模型,溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose,CMC-Na),連續(xù)注射15 d;空白組注射0.5%CMC-Na溶劑(0.2 mL/10 g)[19-20]。造模成功后,別嘌醇陽性組與姜黃素組每天給藥1次(0.1 mL/10 g),連續(xù)灌胃15 d,空白組及模型組予等體積蒸餾水灌胃。

1.2.2.2 肝、腎系數(shù)及相關(guān)酶活測定 末次給藥后禁食24 h,次日小鼠水合氯醛麻醉下眼眶后靜脈叢采血,全血于3500 r/min(-4 ℃)低溫離心15 min,吸取上層血清-20 ℃保存,用于后續(xù)各指標(biāo)檢測。隨后于冰臺(tái)上快速取出肝臟與腎臟,精密稱重,計(jì)算肝腎系數(shù),4%多聚甲醛溶液固定后用石蠟包埋,通過HE染色進(jìn)行病理組織學(xué)檢查。按照試劑盒說明書操作測定各組小鼠血清中尿酸(UA)及黃嘌呤氧化酶(XOD)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)

2.1.1 熱刺激法-熱板刺激法制備小鼠疼痛模型 熱板刺激法是基于小鼠足部溫度感受器接受熱刺激后將信息傳到高位中樞,并在其參與下完成的軀體縮爪反應(yīng),該方法簡便易行,且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物損傷較小[21]。從表1可知,用藥前基礎(chǔ)痛閾測定,空白組、姜黃素各組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。同空白對(duì)照組對(duì)比,姜黃素A1、A2組均能使小鼠痛閾值延長,其中A2組給藥后痛閾值由(18.7±2.6) s延長到(23.6±2.7) s,差異極顯著(P<0.01);表明姜黃素具有鎮(zhèn)痛作用,且85 mg·kg-1為姜黃素發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用最佳劑量。

表1 各組小鼠痛閾值變化情況Table 1 Changes of pain threshold in mice of each group

2.1.2 化學(xué)刺激法-醋酸刺激法制備小鼠疼痛模型 從表2可知,同空白對(duì)照組相比,姜黃素各給藥組能減少小鼠扭體次數(shù),差異具有顯著性(P<0.05,P<0.01),且A2、A4組還可極顯著延長扭體潛伏期(P<0.01),A2組較A4組作用更明顯。表明姜黃素有顯著鎮(zhèn)痛效果,且85 mg·kg-1為姜黃素發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的最佳劑量。

表2 姜黃素對(duì)冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)次數(shù)影響Table 2 Effects of curcumin on the number of writhing reactions induced by glacial acetic acid in mice

疼痛是高尿酸血癥痛風(fēng)的典型特征,以鎮(zhèn)痛實(shí)驗(yàn)確定姜黃素鎮(zhèn)痛最佳劑量,結(jié)果表明姜黃素有顯著鎮(zhèn)痛效果,85 mg·kg-1為姜黃素發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的最佳劑量。

2.2 姜黃素對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠的作用研究

2.2.1 姜黃素對(duì)高尿酸血癥小鼠肝腎系數(shù)的影響 由表3可知,同空白組比較,模型組肝腎系數(shù)極顯著增加(P<0.01),表明氧嗪酸鉀造模后,持續(xù)的高尿酸可引起肝腎損傷。同模型組比較,陽性藥別嘌醇組肝腎系數(shù)有極顯著性降低(P<0.01),姜黃素組顯著降低肝系數(shù)(P<0.05),腎系數(shù)極顯著降低(P<0.01)。

表3 小鼠肝腎系數(shù)Table 3 Liver and kidney coefficient in mice

2.2.2 姜黃素對(duì)高尿酸血癥小鼠血清中尿酸(UA)及黃嘌呤氧化酶(XOD)含量的影響 XOD是黃嘌呤氧化還原酶的一種,廣泛分布于哺乳動(dòng)物中,在肝臟中濃度較高,對(duì)次黃嘌呤和黃嘌呤的氧化有催化作用[22-24]。高尿酸血癥患者體內(nèi)由于肝臟代謝活動(dòng)增強(qiáng),導(dǎo)致肝細(xì)胞細(xì)胞膜的通透性增加,使得血清中XOD的含量與體內(nèi)XOD的含量呈現(xiàn)一定的數(shù)量關(guān)系[25]。因此血清XOD的活性可作為檢測指標(biāo)來說明小鼠體內(nèi)XOD的活性,從而反映藥物降尿酸的作用。由表4可知,同空白組比較,模型組尿酸及黃嘌呤氧化酶含量極顯著升高(P<0.01),表明高尿酸血癥模型造模成功。與模型組比較,陽性藥組、姜黃素組的尿酸及黃嘌呤氧化酶含量極顯著下降(P<0.01),表明姜黃素具有較強(qiáng)的降尿酸能力。

表4 小鼠血清中尿酸(UA)及黃嘌呤氧化酶(XOD)含量Table 4 Expression of UA and XOD in serum of mice with hyperuricemia

2.2.3 姜黃素對(duì)高尿酸血癥小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)含量的影響 ALT和AST是臨床上最常用的肝酶指標(biāo)。ALT存在于肝細(xì)胞的胞質(zhì)中,特異性較高,一旦肝細(xì)胞出現(xiàn)變性,膜通透性增加,血清ALT水平也隨之升高,可反映肝臟的損傷情況;AST多存在于心、腎、肝等部位,一旦肝臟受損嚴(yán)重,線粒體中將逸出AST,可有效反映肝細(xì)胞的損傷情況[26]。由表5可知,同空白組比較,模型組中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量極顯著升高(P<0.01),表明持續(xù)的高尿酸可引起肝臟損傷。與模型組比較,陽性藥組、姜黃素組中谷草轉(zhuǎn)氨酶及谷丙轉(zhuǎn)氨酶的含量顯著下降(P<0.05),表明姜黃素有一定的肝損傷防治作用。

表5 小鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)含量Table 5 Expression of ALT and AST in serum of

圖1 姜黃素對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肝腎的影響(200×)Fig.1 Effects of curcumin on the influence of liver and kidney in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate(200×)注:△:細(xì)胞水腫;□:炎癥浸潤;◇:腎小管擴(kuò)張。

2.2.4 姜黃素對(duì)高尿酸血癥小鼠血清中肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)含量的影響 血清CRE和BUN是臨床診斷和評(píng)估腎臟損傷的常用指標(biāo),二者均通過腎臟代謝,當(dāng)腎臟受損時(shí)其水平明顯升高,可有效反映腎功能受損程度。由表6可知,同空白組比較,模型組中尿素氮、肌酐的含量極顯著升高(P<0.01),表明持續(xù)的高尿酸可引起腎臟損傷。與模型組比較,陽性藥組、姜黃素組中肌酐及尿素氮極顯著下降(P<0.01),表明姜黃素在保護(hù)腎功能上有一定功效。

表6 小鼠血清中肌酐(CRE)及尿素氮(BUN)含量Table 6 Expression of CRE and BUN in serum of mice with hyperuricemia

2.2.5 小鼠肝腎組織病理變化 由圖1可知,模型組小鼠肝臟中部分細(xì)胞水腫,肝小體邊界不明顯,周圍有明顯的炎癥浸潤;腎臟中腎小管擴(kuò)張,炎癥浸潤明顯。與模型組相比,別嘌醇組、姜黃素組中肝組織表現(xiàn)為肝小體、肝小葉相對(duì)完整,炎癥浸潤相對(duì)減少;腎中腎小管擴(kuò)張數(shù)目減少,炎癥浸潤減少。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明姜黃素對(duì)氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠具有較好的降尿酸及肝腎保護(hù)作用。姜黃素可下調(diào)高尿酸血癥小鼠的肝腎系數(shù),降低小鼠血清中UA及XOD含量,改善高尿酸引起的肝腎損傷;姜黃素組小鼠血清ALT、AST、CRE、BUN含量顯著降低,肝腎病理圖顯示姜黃素組中肝腎組織均有不同程度的改善,表現(xiàn)為肝小體、肝小葉相對(duì)完整,細(xì)胞水腫面積縮小,炎癥浸潤相對(duì)減少;腎小管腫大減少,炎癥浸潤相對(duì)減少,表明姜黃素在保護(hù)肝腎上療效顯著。本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可顯著降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸,并有保護(hù)肝腎的作用,但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步的探索研究,本實(shí)驗(yàn)可為新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。