何 莉，劉 蕓2，張 瑤3，梁 昊，張秋雁，聶 娟，楊 漾，謝 輝

缺血性心臟病是由于冠狀動(dòng)脈循環(huán)改變引起冠狀動(dòng)脈血流和心肌需求之間不平衡而導(dǎo)致的心肌損害，其中以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的冠狀動(dòng)脈狹窄和閉塞為特征的冠心病(coronary artery disease， CAD)是其最常見類型，嚴(yán)重危害人類健康，盡管人們采取了各種現(xiàn)代化治療方法，如靜脈溶栓、抗血小板聚集、心臟介入等，其發(fā)病率和死亡率均仍居各類致死性疾病前列。CAD發(fā)生后，除疏通阻塞的冠狀動(dòng)脈外，還可以通過血管新生產(chǎn)生側(cè)支循環(huán)實(shí)現(xiàn)“自我搭橋”，挽救更多的心肌，從而降低病死率[1-2]。作為血管內(nèi)皮前體細(xì)胞的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)在血管新生中扮演著重要的角色[3]。然而，病理狀態(tài)下EPCs存在衰老現(xiàn)象，嚴(yán)重影響其增殖和功能[4]。因此，延緩EPCs衰老、促進(jìn)EPCs的遷移是實(shí)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈阻塞后血管新生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

活血化瘀是中醫(yī)學(xué)治療冠心病的根本大法，血府逐瘀湯又是活血化瘀的經(jīng)典名方，大量臨床研究證實(shí)其具有較好的抗心肌缺血作用。研究發(fā)現(xiàn)血府逐瘀湯可誘導(dǎo)EPCs遷移至缺血區(qū)，促進(jìn)血管新生，進(jìn)而改善缺血區(qū)心肌缺血壞死[5]，這種作用可能是通過抗EPCs衰老而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)觀察血府逐瘀湯對血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導(dǎo)的大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老、遷移功能及miR-34a表達(dá)的影響，探討血府逐瘀湯抗衰老的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 取原代EPCs用的SD雄性大鼠40只，4周齡，體質(zhì)量100 ～110 g，動(dòng)物合格證：43004700025025。取血清用的SD雄性大鼠，40只，體質(zhì)量250 ～280 g，動(dòng)物合格證：43004700024153。以上動(dòng)物均由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度20～25 ℃，濕度55%～60%，通氣良好。

1.2 藥物 血府逐瘀湯出自王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，組方：當(dāng)歸三錢(9 g)，生地三錢(9 g)，桃仁四錢(12 g)，紅花三錢(9 g)，枳殼二錢(6 g)，赤芍二錢(6 g)，柴胡一錢(3 g)，甘草二錢(6 g)，桔梗一錢半(4.5 g)，川芎一錢半(4.5 g)，牛膝三錢(9 g)。藥材購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。藥液制備：加10倍量水浸泡0.5 h，然后用電熱套加熱回流提取1 h，濾過；第2次加8倍量水，同法再煮1 h。合并兩次煎液，濃縮至含生藥量1.56 g/mL。

1.3 試劑 EGM-2培養(yǎng)基：美國LONZA公司(CC-4147)；青-鏈霉素：碧云天公司(ST488)；大鼠骨髓源淋巴細(xì)胞分離液：天津?yàn)蠊?LTS1083)；磷酸緩沖鹽溶液(PBS)：Hyclone公司(SH30256.01B)；DMEM高糖培養(yǎng)基：Hyclone公司(SH30023.01B)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)：BI公司(04-001-1A/B)；細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒：碧云天公司(C0602)；β-actin：美國proteintech公司(60008-1-Ig)；AngⅡ：阿拉丁公司(4474-91-3)；CD133一抗：美國Novus公司(NB120-16518)；CD34抗體：美國Santa Cruz公司(SC-7324-FITC)；CD”133二抗：美國CST公司(14705s)；mirVanaTMmiRNA 分離試劑盒：美國Life technologies公司(AM1556)；iRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：美國GeneCopoeia公司(QP014)。

1.4 儀器 超凈工作臺(tái)：北京亞泰(YT-CJ-2NB)公司；低速離心機(jī)：知信儀器(SL02)公司；二氧化碳培養(yǎng)箱：上海三藤儀器(DH-160I)公司；立體顯微鏡：上海光學(xué)儀器一廠(XTZ-D/E)公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國eppendorf(TGL-18R)；熒光定量RCP儀：美國Thermo(PIKO REAL 96)；熒光PCR板：美國Thermo(SPL0960)；恒溫水浴箱：河南金博(HH-S2)公司；電泳儀：中國Bio-rad(164-5050)；轉(zhuǎn)膜儀：北京六一(DYCZ-40A)公司；磁力攪拌器：榮華(a85-1)公司。

1.5 大鼠骨髓源EPCs 的分離、培養(yǎng) 大鼠脫頸處死，浸泡在 75%乙醇里 15 min，移至消毒托盤內(nèi)，將后肢去皮連同肌肉取下，放至玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，無菌分離股骨、脛骨，將附著于骨頭上的肌肉剔除干凈，放至另一玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)，6 mL PBS 清洗3遍，將黏附肌肉清洗干凈，剪斷一端骨骺端，用注射器抽取 EGM-2 培養(yǎng)基 6 mL，將骨髓沖到離心管內(nèi)，取大鼠骨髓淋巴細(xì)胞分離液 6 mL，使用 1 mL 槍頭吸取細(xì)胞懸液沿管壁傾斜 45°小心加至淋巴細(xì)胞分離液上，注意保持兩層間形成明顯界面，水平離心 2 000 r/min，離心 20 min。離心后管內(nèi)分3層，培養(yǎng)基在上層，紅細(xì)胞、粒細(xì)胞以及其他雜質(zhì)在下層，中層為淋巴細(xì)胞分離液，上、中層分界處有一以單個(gè)核細(xì)胞為主的云霧狀薄層，用槍頭小心插至云霧層，將此層細(xì)胞全部吸入到另一離心管中，并加入10 mL 培養(yǎng)液，輕輕吹打洗滌，1 000 r/min離心10 min。離心后去上清，底部沉淀即為單個(gè)核細(xì)胞，用培養(yǎng)基輕輕吹打混勻，制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液按1×106個(gè)/mL 濃度移入預(yù)先包被細(xì)胞纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的培養(yǎng)瓶，置37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，每 3 d換液 1 次。

1.6 EPCs的免疫熒光鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)到第14天，使用胰蛋白酶對細(xì)胞進(jìn)行消化，1 000 r/min離心5 min，收集細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先放置爬片的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h；取出爬片，PBS清洗3次，將爬片用4%多聚甲醛固定30 min；PBS沖洗5 min×3次，5% tritonX-100通透37 ℃30 min；PBS沖洗5 min×3次；5% BSA封閉1 h；孵育一抗，滴加適當(dāng)?shù)囊豢?CD34-FITC、CD133)，4 ℃過夜。同樣用PBS沖洗5 min×3次，滴加抗兔IgG標(biāo)記熒光抗體200 L，在37 ℃下孵育90 min；PBS清洗5 min×3次，DAPI染核：DAPI工作液37 ℃孵育10 min；90%甘油封片，到熒光顯微鏡下觀察。

1.7 含藥血清制備 SD大鼠40只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為空白血清組和血府逐瘀湯含藥血清組，每組20只，血府逐瘀湯含藥血清組按14 g/(kg·d)，即按70 kg成人體表面積(平均)換算，相當(dāng)于成人用量的10倍劑量灌胃，空白血清組用等量生理鹽水，1次/日，連續(xù)7 d。于末次用藥后2 h，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，于4 ℃靜置2 h，1 500 r/min離心15 min，提取上清液為含藥血清，經(jīng)56 ℃水浴中30 min進(jìn)行滅活，0.22 m過濾器過濾除菌，放置-20 ℃保存?zhèn)溆?，需要時(shí)用培養(yǎng)液配制成所需濃度的含藥血清。

1.8 AngⅡ誘導(dǎo)EPCs 衰老及分組 將EPCs培養(yǎng)至第10天，根據(jù)文獻(xiàn)資料[6]，將細(xì)胞培養(yǎng)在100 nmol/L 濃度AngⅡ的培養(yǎng)液中，誘發(fā)EPCs的衰老，利用細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒進(jìn)行染色，驗(yàn)證AngⅡ誘導(dǎo)EPCs衰老是否成功。同時(shí)，將上述EPCs隨機(jī)分為：正常組(不做處理)、模型組(15%對照組大鼠血清+100 nmoL AngⅡ處理)、5%含藥血清組(5%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、10%含藥血清組(10%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、15%含藥血清組(15%含藥血清+100 nmoL AngⅡ處理)、抑制劑組(miR-34a抑制劑+100 nmoL AngⅡ處理)，分別處理24 h、48 h、72 h后收集細(xì)胞。

1.9 β-半乳糖苷酶檢測EPCs衰老情況 細(xì)胞衰老染色試劑盒，以X-gal為底物，在衰老特異性的β-半乳糖苷酶催化下會(huì)生成深藍(lán)色產(chǎn)物，從而在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到變成藍(lán)色的表達(dá)β-半乳糖苷酶的細(xì)胞或組織。按該原理定性、定量測定EPCs衰老情況，普通光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取每只5個(gè)視野觀察，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中衰老細(xì)胞數(shù)目，取其平均數(shù)。

1.10 Transwell小室對EPCs遷移能力進(jìn)行檢測 在Transwell小室的下室鋪FN，先將EPCs使用無血清及生長因子的培養(yǎng)基進(jìn)行饑餓培養(yǎng)24 h，去除血清的影響；胰酶消化細(xì)胞，用PBS洗一遍，用無血清培養(yǎng)基將EPCs重懸 ，調(diào)整密度至1×105個(gè)；取200 μL細(xì)胞懸液加入上室，下室按分組分別加入空白血清培養(yǎng)基、5%、10%、15%含藥血清培養(yǎng)基及miR-34a抑制劑培養(yǎng)基500 μL；常規(guī)培養(yǎng)18 h；用棉簽將上室內(nèi)的細(xì)胞擦去，將下室的細(xì)胞進(jìn)行DAPI染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

1.11 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法檢測miR-34a的表達(dá) 提取細(xì)胞miRNA：分別干預(yù)24 h、48 h、72 h后，按試劑盒說明提取各組細(xì)胞的總RNA。逆轉(zhuǎn)錄。引物的設(shè)計(jì)與合成：U6：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′rno-miR-34a-5p：TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTGT。PCR擴(kuò)增：Template(反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物)1 L，Primer A(10 m)0.5 L，Primer B(10 m)0.5 L，PCR H2O 13 L，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 L。上機(jī)95 ℃，10 min；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s，共40個(gè)循環(huán)。

2 結(jié) 果

2.1 免疫熒光鑒定 熒光顯微鏡下觀察，藍(lán)色為DAPI藍(lán)色染核(見圖1)，綠色為CD34熒光染色(見圖2)，紅色為CD133熒光染色(見圖3)，陽性染色為CD34-FITC綠色和CD133紅色熒光信號(hào)(見圖4)，陽性染色即為EPCs。

圖1 DAPI染核(×400)

圖2 CD34熒光染色(×400)

圖3 CD133熒光染色(×400)

圖4 CD34/CD133雙染(×400)

2.2 對EPCs衰老的影響 鏡下觀察，藍(lán)色即為衰老細(xì)胞。干預(yù)24 h、48 h、72 h與正常組比較，模型組EPCs衰老數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組和5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數(shù)量減少(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs衰老數(shù)量明顯減少(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組的EPCs衰老數(shù)量減少(P<0.01)。各組EPCs衰老數(shù)量在24 h、48 h、72 h這3個(gè)干預(yù)時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果表明，血府逐瘀湯含藥血清能延緩EPCs衰老，在3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組不同時(shí)間EPCs衰老數(shù)量比較(±s) 單位： 個(gè)

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01。

2.3 對EPCs遷移功能的影響 與正常組比較，模型組EPCs遷移數(shù)量明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組、5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數(shù)量減少(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組EPCs遷移數(shù)量明顯增多(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組EPCs遷移數(shù)量明顯增多(P<0.01)。3個(gè)劑量以15%含藥血清組對EPCs遷移作用效果最優(yōu)。詳見表2。

表2 各組EPCs遷移數(shù)量比較 (±s) 單位：個(gè)

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01。

2.4 對miR-34a表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組中miR-34a表達(dá)量在3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，miR-34a抑制劑組和10%含藥血清組、15%含藥血清組中miR-34a的表達(dá)量在3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間均降低(P<0.01)，5%含藥血清組在干預(yù)48 h、72 h顯著降低(P<0.01)；與miR-34a抑制劑組比較，5%含藥血清組、10%含藥血清組、15%含藥血清組中miR-34a表達(dá)量在3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間均明顯升高(P<0.01)；與5%含藥血清組比較，10%含藥血清組、15%含藥血清組miR-34a表達(dá)量在3個(gè)不同干預(yù)時(shí)間均明顯降低(P<0.01)；與10%含藥血清組比較，15%含藥血清組在干預(yù)48 h顯著降低(P<0.01)；3個(gè)濃度中以15%含藥血清效果最佳，3組在不同干預(yù)時(shí)間點(diǎn)間比較多數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組不同時(shí)間EPCs中miR-34a表達(dá)水平比較(±s)

與正常組比較，①P<0.01；與模型組比較，②P<0.01；與miR-34a抑制劑組比較，③P<0.01；與5%含藥血清組比較，④P<0.01；與10%含藥血清組比較，⑤P<0.01；與組內(nèi)干預(yù)24 h比較，⑥P<0.01；與組內(nèi)干預(yù)48 h比較，⑦P<0.05，⑧P<0.01。

3 討 論

EPCs 是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，亦稱為成血管細(xì)胞，正常情況下大多處于休眠狀態(tài)，在生理或病理因素刺激下能從骨髓動(dòng)員到外周血、在體內(nèi)缺血組織中整合形成新生血管的前體細(xì)胞。外源EPCs治療冠心病已從基礎(chǔ)研究推廣至臨床，能明顯改善心肌梗死病人和介入手術(shù)病人的預(yù)后。EPCs具有分化、遷移、血管新生、修復(fù)功能，在冠心病的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要角色[7]。冠心病病人循環(huán)血中EPCs的數(shù)量下降了近50%，黏附、遷移能力受損，經(jīng)過跟蹤隨訪，EPCs數(shù)量及功能下降病人的預(yù)后更差[8]。大部分正常細(xì)胞在盡其有限的分裂后，衰老現(xiàn)象也會(huì)接踵而來，衰老雖然并不意味著細(xì)胞的死亡，但它的蛋白以及基因的表達(dá)譜可能翻天覆地改變，以至于在遇到刺激后不能再分裂。老齡、吸煙、動(dòng)脈粥樣硬化、高血糖等冠心病危險(xiǎn)因素均可引起EPCs衰老，EPCs的衰老會(huì)使其增殖和功能受到影響，而冠心病病人多伴有以上危險(xiǎn)因素，與EPCs衰老互為因果，形成惡性循環(huán)，阻礙血管新生，逐漸引起心血管領(lǐng)域?qū)W者的關(guān)注。

miR-34a屬于miR-34家族，其生物學(xué)功能主要有細(xì)胞周期阻滯、促進(jìn)細(xì)胞衰老及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、組織細(xì)胞遷移[9]。自miR-34a被發(fā)現(xiàn)就一直因其對各類細(xì)胞的衰老、凋亡增殖作用而備受關(guān)注[10]，許多細(xì)胞凋亡及衰老的研究就是以此作為突破點(diǎn)逐漸明確了某些疾病的發(fā)生機(jī)制及藥物的作用機(jī)制[11]。有研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a后，誘發(fā)細(xì)胞衰老[12-13]。

本課題組前期研究已證實(shí)，血府逐瘀湯可上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)等血管新生因子的表達(dá)，促進(jìn)心肌缺血區(qū)的血管新生[14-15]。本實(shí)驗(yàn)通過原代培養(yǎng)大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞，使用AngⅡ誘導(dǎo)其衰老，觀察血府逐瘀湯對AngⅡ誘導(dǎo)的大鼠骨髓源內(nèi)皮祖細(xì)胞、遷移功能及miR-34a表達(dá)的影響，結(jié)果表明：血府逐瘀湯能減輕內(nèi)皮祖細(xì)胞的衰老，其機(jī)制可能與改善EPCs的遷移功能、下調(diào)miR-34a的表達(dá)有關(guān)。