(南京海關(guān)動植物與食品檢測中心,江蘇南京 210000)

目前,TCs的檢測方法有紫外分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)、微生物法(microorganism method)[7]、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)[8-9]、質(zhì)譜法(massspectrometry,MS)[10]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chrometography-massspectrometry,LC-MS)[11-13]、薄層色譜法(thin layer chromatography,TLC)、毛細管電泳法(capillary electrophoresis,CE)、化學(xué)發(fā)光法(chemiluminescence,CL)、酶聯(lián)免疫檢測法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)[14-15]。色譜方法操作步驟繁瑣,且需精密儀器,而免疫分析法具有操作簡便快速、特異性高等特點,有良好的應(yīng)用前景。競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(cempetitive chemiluminescent enzyme immunity,CLEIA)是將化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種技術(shù),具有靈敏度高、線性范圍寬、分析方法更簡便快速、穩(wěn)定性強等特點。

本研究建立一種用于四環(huán)素的競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫定量測定法,并對反應(yīng)參數(shù)進行優(yōu)化以提高檢測的特異性及靈敏度,以期為四環(huán)素的定量測定提供一種簡便的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20只雄性小鼠 體重20～25 g,北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,飼養(yǎng)于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心;四環(huán)素、金霉素、土霉素、強力霉素、氯霉素、青霉素 純度為99%，美國Sigma公司;四環(huán)素單抗 蘇州快捷康公司;血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin,KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)以及卵清白蛋白(ovalbumin,OVA) 美國Sigma公司;包被液 0.05 mol/L碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液,pH9.6;封閉液 1%BSA溶液;洗液 0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖溶液(PBST);稀釋液 磷酸鹽緩沖液(PBS);HRP-四環(huán)素單抗用辣根過氧化酶(HRP)標記的四環(huán)素單抗 可4 ℃短期保存,-20 ℃長期保存;CLEIA化學(xué)發(fā)光液 AB液1∶1混合液,現(xiàn)用現(xiàn)配,A液魯米諾含量為0.01 mol/L、對甲苯酚含量為0.001 mol/L pH8.8的三羥甲基氨基甲烷溶液,B液每100 mL溶液含檸檬酸2.1 g、無水Na2HPO42.82 g、0.75%的過氧化氫脲0.64 mL的水溶液。

DK-8D恒溫水浴鍋 上海森信實驗儀器有限公司;96孔化學(xué)發(fā)光可拆卸白板 美國Corning公司;PHX-2012化學(xué)發(fā)光儀 北京普朗新科技有限公司;MULTISKAN FC酶標儀、Ultra液質(zhì)聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;LP115 pH計 德國MettlerToledo GmbH公司;TISS-24組織研磨儀 上海凈信科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 稱取0.1 mg四環(huán)素標準品,用1 mL PBS溶解成0.1 mg/mL的母液。吸取10 μL母液到9.99 mL PBS溶液中制備成100 μg/L的標準品1;吸取5 mL標準品1加到5 mL PBS溶液中制備成50 μg/L的標準品2;吸取1 mL標準品2加到4 mL PBS溶液中制備成10 μg/L的標準品3;吸取1 mL標準品3加到9 mL PBS溶液中制備成1 μg/L的標準品4;吸取1 mL標準品4加到9 mL PBS溶液中制備成0.1 μg/L的標準品5;吸取1 mL標準品5加到9 mL PBS溶液中制備成0.01 μg/L的標準品6,制備成一系列濃度(0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)的四環(huán)素標準溶液。

1.2.2 抗原包被載體蛋白的選擇 將四環(huán)素與BSA/OVA/KLH進行偶聯(lián):稱取10 mg載體蛋白,加入10 mL(0.1 mol/L)的MES緩沖液中,配制成1 mg/mL的A溶液;量取100 μL(10 mg/mL)四環(huán)素溶于DMSO中,補加400 μL DMF,配制成B溶液;將B溶液逐滴加入到A溶液中,邊加邊用力攪拌;補加7.35 mL DMF,然后迅速加入37%甲醛3.57 mL,于37 ℃水浴振蕩反應(yīng)24 h;4 ℃條件下用去離子水充分透析16～24 h,平均每4 h換一次蒸餾水,將其分裝真空冷凍干燥機凍干后備用。應(yīng)用Bradford法對偶聯(lián)前后各載體蛋白濃度進行測定,計算各載體蛋白的偶聯(lián)效率[16]。

根據(jù)相關(guān)要求，進一步明確洪澤湖水源調(diào)度：①洪澤湖水位在12.5 m以上時，水源由省防汛防旱指揮部統(tǒng)一調(diào)度。②當洪澤湖水位在12.5 m以下時，按省規(guī)定，除經(jīng)薔北地涵及沭新退水閘（含桑墟水電站）向連云港市送水50 m3/s、向廢黃河送水15～20 m3/s外，其余部分由省防汛防旱指揮部統(tǒng)一調(diào)度給淮安、宿遷等市縣使用。③當洪澤湖水位降至11.3 m時，由于二河閘出量不足， 向連云港市及廢黃河送水的流量將相應(yīng)減少，但為了確保連云港港口和城市用水，根據(jù)大旱年份1992年的實際情況，在任何形式下，通過薔北地涵及沭新退水閘向連云港送水不得少于30～40 m3/s。

偶聯(lián)效率(%)=(偶聯(lián)前載體蛋白濃度-偶聯(lián)后載體蛋白濃度)/四環(huán)素質(zhì)量×反應(yīng)體積

1.2.3 CLEIA測定法反應(yīng)條件的優(yōu)化 用包被液稀釋偶聯(lián)抗原底物至1 μg/mL,100 μL/孔包被于96孔化學(xué)發(fā)光板,4 ℃孵育過夜。棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加封閉液,200 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。每孔加入100 μL四環(huán)素抗原(1 μg/L)和100 μL HRP-四環(huán)素抗體(1 μg/mL),分別在室溫(20 ℃)和37 ℃下振蕩反應(yīng)20、30、60 min,以及不振蕩反應(yīng)20、30、60 min,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加入化學(xué)發(fā)光液100 μL/孔,立刻置于化學(xué)發(fā)光儀上讀相對發(fā)光值(relative light unit,RLU)。選擇RLUmax最大、IC50值最小、RLUmax/IC50最大的反應(yīng)條件作為該測定法的反應(yīng)體系,此時的檢測范圍最廣、靈敏度最低。

1.2.4 競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)標準曲線的確立 用包被液稀釋偶聯(lián)抗原底物至1 μg/mL,100 μL/孔包被于96孔化學(xué)發(fā)光板,4 ℃ 孵育過夜。棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加封閉液,200 μL/孔,37 ℃ 孵育2 h,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。每孔加入100 μL四環(huán)素抗原(濃度分別為0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)和100 μL HRP-四環(huán)素抗體(1 μg/mL),37 ℃ 振蕩孵育30 min,棄掉液體,PBST洗5次,30 s/次,拍干。加入化學(xué)發(fā)光液100 μL/孔,立刻置于化學(xué)發(fā)光儀上讀相對發(fā)光值(relative light unit,RLU)。以四環(huán)素標準品濃度為X軸,以抑制率為Y軸繪制標準曲線。

1.2.5 競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法性能評估 用PBS稀釋制備一系列濃度(0.01、0.1、1、10、50、100 μg/L)的四環(huán)素標準品,按照1.2.3部分所示步驟,在最優(yōu)實驗條件下,繪制標準曲線。

檢測限是指IC10所對應(yīng)的濃度值。檢測范圍是指IC15～IC90所對應(yīng)的濃度值范圍。靈敏度是指抑制率為50%時(IC50)的濃度。

1.2.6 添加回收試驗

1.2.6.1 樣品前處理 隨機選擇市場上的空白豬肉(去除脂肪)、魚肉(去除骨頭)、雞肝作為實驗樣本,添加不同濃度的四環(huán)素標準品后,每份樣品各取0.5 g,加1 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液后用組織研磨儀研磨5 min,再加入1 mL PBS振蕩混勻,4 ℃、5000 r/min離心30 min取全部上清用2 mol/L NaOH調(diào)pH為7.4,pH計測定pH。

1.2.6.2 樣品制備 采用外標法,向上述樣品中分別添加不同體積的工作溶液,制成不同加標濃度(50、100、200、300、600 μg/kg)的加標樣品。各濃度進行5個樣品平行試驗,計算回收率及變異系數(shù)(CV)。

1.2.7 四環(huán)素中毒小鼠模型的建立

1.2.7.1 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng) 20只雄性小鼠,飼養(yǎng)于無菌環(huán)境,通風換氣良好,溫度18～22 ℃,濕度45%～65%,房間光線良好,自由覓食進水,自由活動。按照江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗動物中心實驗動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定進行動物實驗。

1.2.7.2 模型建立 將20只小鼠隨機分為空白對照組和四環(huán)素造模組,每組各10只。四環(huán)素造模組每天腹腔注射劑量為0.2 g/kg體重的四環(huán)素標準品(溶于PBS溶液中),空白對照組每天腹腔注射等體積的PBS溶液,連續(xù)給藥4 d。停止給藥后無需禁食,第2 d 0.5 mL 20%烏拉坦腹腔注射麻醉,仰臥于解剖盤上,取肝臟、腎臟、肌肉。

1.2.7.3 動物組織處理方法 剪取肝臟、腎臟、肌肉各0.5 g,加1 mL 0.1 mol/L高氯酸溶液后用組織研磨儀研磨5 min,再加入1 mL PBS 振蕩混勻,4 ℃、5000 r/min離心30 min后取上清液,用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH為7.4,pH計測定pH。

1.2.8 液質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS)測定 依據(jù)國標方法GB/T 21317-2007,采用液質(zhì)聯(lián)用儀測定樣本中四環(huán)素的含量。色譜柱為Inertsil C8-3(150 mm×2.1 mm),粒度5 μm;流動相:甲醇(4.1)+10 mmol/L三氟乙酸(4.15);流速:300 μL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:30 μL。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)處理,圖表繪制采用Graphpad Prism 5繪圖軟件,組間比較采用t檢驗。以P<0. 05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 抗原包被載體蛋白的選擇

將小分子抗原物質(zhì)包被在酶標板上是建立競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法的一個關(guān)鍵步驟。當抗原分子量較小或者分子極性較強時,抗原分子往往不容易被包被在酶標板上,因此需要將小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)載體蛋白偶聯(lián),制備可以用于包被固相載體的半抗原載體蛋白復(fù)合物,進而提高包被效率[17-18]。常用的與小分子物質(zhì)偶聯(lián)的載體蛋白有牛血清白蛋白(BSA)、雞卵白蛋白(OVA)、血藍蛋白(KLH)、多聚賴氨酸(poly-l-lysine,PLL)等[19]。

將四環(huán)素與不同載體蛋白進行偶聯(lián),應(yīng)用Bradford法對偶聯(lián)蛋白進行定量分析,計算各載體蛋白的偶聯(lián)效率。如圖1所示,BSA的偶聯(lián)效率為0.887 mg BSA/mg四環(huán)素,OVA的偶聯(lián)效率為0.777 mg OVA/mg四環(huán)素,KLH的偶聯(lián)效率為0.583 mg KLH/mg四環(huán)素。與BSA偶聯(lián)四環(huán)素的偶聯(lián)效率相比,OVA和KLH的偶連效率均較低,且差異極顯著(P<0.001)。由于BSA的偶聯(lián)效率較高,效果較好,所以選擇BSA作為偶聯(lián)載體蛋白。

圖1 不同載體蛋白偶聯(lián)效率Fig.1 The coupling efficiency of different carrier proteins注:***表示與BSA相比，差異極顯著，P<0.001。

2.2 CLEIA測定法反應(yīng)條件的優(yōu)化

按照如上1.2.3實驗方法在室溫(20 ℃)和37 ℃下振蕩反應(yīng)20、30、60 min,不振蕩反應(yīng)20、30、60 min,比較不同反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間及振蕩條件下的標準曲線。如圖2所示,圖中左邊Y軸為0濃度背景值最大發(fā)光值RLUmax,右邊Y軸為RLUmax和靈敏度IC50的比值。在37 ℃振蕩反應(yīng)30 min時,RLUmax最大、IC50值最小、RLUmax/IC50最大,此時的檢測范圍最廣、靈敏度最低。故反應(yīng)條件為37 ℃,振蕩反應(yīng)30 min。

圖2 CLEIA法測定TC體系振蕩、反應(yīng)溫度及時間的影響Fig.2 The effect of oscillation,incubation temperature and time on TC detection by CLEIA注:A1～A3:20 ℃振蕩20、30、60 min;A4～A6:20 ℃不振蕩20、30、60 min;B1～B3:37 ℃振蕩20、30、60 min;B4～B6:37 ℃不振蕩20、30、60 min。

2.3 競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)的建立

優(yōu)化各參數(shù)后建立了檢測四環(huán)素的競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(TC-CLEIA)。如圖3所示,其相關(guān)系數(shù)r為0.9998(Y=51.1479+21.2557lgX),檢測范圍為0.0259～95.9478 μg/L,檢測限為0.0133 μg/L,準確度為99.17%,靈敏度為0.7305 μg/L。當抗原濃度分別為1和10 μg/L時,其變異系數(shù)CV分別為5.12%和3.79%,表明該體系重復(fù)性良好。

圖3 CLEIA法測定TC標準曲線Fig.3 Standard curve of TC detection by CLEIA

2.4 競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)交叉反應(yīng)

將四環(huán)素、金霉素、土霉素等分別按照1.2.1實驗方法配制一系列濃度的標準溶液,計算IC50值及交叉反應(yīng)率。檢測結(jié)果如表1所示,四環(huán)素與同族的金霉素、土霉素、強力霉素稍有交叉反應(yīng),且交叉反應(yīng)率較高,而與其他氯霉素、青霉素的交叉反應(yīng)率極低。

2.5 添加回收試驗

按照上述1.2.6方法,在空白豬肉(去除脂肪)、魚肉(去除骨頭)、雞肝中添加三個不同濃度的四環(huán)素工作溶液,分別用TC-CLEIA和LC-MS法進行回收率試驗。各濃度進行5個樣品平行試驗,結(jié)果見表2?？梢钥闯鏊沫h(huán)素的回收率在92.56%～108.56%之間,變異系數(shù)<10%,實際檢測濃度與添加濃度接近。說明CLEIA檢測法的準確度及精密性良好。

表2 豬肉、魚肉、雞肝中四環(huán)素添加回收率試驗Table 2 Recovery test of TC addition in pork,fish and chicken liver

表1 CLEIA測定法檢測四環(huán)素與其他藥物的交叉反應(yīng)性Table 1 The cross-reaction between TC and other drugs detected by CLEIA

圖4 TC的LC-MS譜圖Fig.4 LC-MS spectrum of TC

2.6 競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(CLEIA)檢測四環(huán)素中毒小鼠各組織樣本

與空白對照組小鼠相比,四環(huán)素造模組小鼠腹腔內(nèi)臟器官呈黃褐色,表面不光滑,質(zhì)地較軟,肝臟體積明顯增大。用CLEIA測定法對空白對照組、四環(huán)素造模組小鼠的肝臟、腎臟、肌肉樣本進行檢測,結(jié)果如表3所示。在中毒小鼠肝、腎和肌肉中均能檢測到四環(huán)素,且殘留量按濃度大小依次為:腎臟>肝臟>肌肉。

表3 CLEIA測定法檢測四環(huán)素中毒小鼠各組織中四環(huán)素濃度(n=10)Table 3 The concentration of TC detected by CLEIA in tissues of TC-toxic mice model(n=10)

3 討論與結(jié)論

獸用抗生素殘留是食品安全的重大問題,其中四環(huán)素類抗生素的應(yīng)用十分廣泛[20-21]。目前檢測四環(huán)素類抗生素殘留的方法有很多,李佩佩等[22]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)法對水產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物及其差向異構(gòu)體進行了檢測,曹金博等[23]利用免疫分析技術(shù)檢測了多種動物食品中四環(huán)素類抗生素殘留,邵鈺秀等[24]利用電堆積毛細管電泳法檢測了牛奶、雞蛋、蜂蜜等食品中四環(huán)素類抗生素殘留[25],劉興泉等[26]采用高通量微生物法和HPLC法檢測了豬肉中四環(huán)素和磺胺類抗生素殘留,而本研究則采用化學(xué)發(fā)光和酶聯(lián)免疫反應(yīng)相結(jié)合的技術(shù)來測定食品中四環(huán)素類的殘留,與其他檢測方法相比,本方法靈敏度高、線性范圍廣,檢測更加簡便快速。

本研究選擇適宜的偶聯(lián)載體蛋白,通過優(yōu)化各反應(yīng)條件,建立了一種測定四環(huán)素的競爭化學(xué)發(fā)光酶免疫測定法(TC-CLEIA)。檢測范圍為0.0259～95.9478 μg/L,檢測限為0.0133 μg/L,準確度為99.17%,靈敏度為0.7305 μg/L,變異系數(shù)<10%,對氯霉素、青霉素具有極低的交叉反應(yīng)。在空白豬肉、魚肉、雞肝中添加三個不同濃度的四環(huán)素標準品時,檢測結(jié)果具有較高的準確度和重復(fù)性。該CLEIA檢測法簡便,檢測限低,準確度、重復(fù)性、特異性均很好,符合檢測要求。通過四環(huán)素中毒小鼠模型,檢驗了CLEIA法檢測生物體內(nèi)四環(huán)素的能力。結(jié)果表明,小鼠模型的肝、腎和肌肉中四環(huán)素殘留量按濃度大小依次為:腎臟>肝臟>肌肉。因此,該CLEIA檢測法適用于動物源性食品中四環(huán)素殘留的檢測,當樣本容量較大時,可用該方法進行快速檢測。