陳洋煒,鄭莛予,高云杉,鄭明鋒

(福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002)

繡球菌(Sparassiscrispa)屬擔子菌亞門、異隔擔子菌綱、無褶菌目、繡球菌科[1]。在中國,繡球菌是一種名貴的食用菌,主要分布在東北、云南等林區(qū)中。研究發(fā)現(xiàn),繡球菌多糖是一種β-葡聚糖,其含量占繡球菌子實體干重的43%[2]。β-葡聚糖廣泛的存在于真菌的細胞壁中,約占細胞壁質量的一半,結構穩(wěn)定且具有較強的生物活性[3]。多糖分子質量大小和分子質量分布是決定其物理特性和生理活性的重要因素之一[4]。不同分子量的多糖,在結構上存在一定的差異,導致其有與原多糖功能特性不同[5],但由于多糖的分子量較大,不利于研究其結構特性,以至于其活性和結構的關系無法說明。通過適當?shù)姆椒ń到舛嗵?可降低多糖粘度,增強水溶性,有利于細胞等生物體的吸收,而且有研究表明低分子量的多糖具有更好的生物活性。Ishimoto等[6]對酵母β-葡聚糖進行45%硫酸降解,發(fā)現(xiàn)分子量更小的葡聚糖表現(xiàn)出對dectin-1更好的結合效果,且其對巨噬細胞產生的活性氧和細胞因子表現(xiàn)出拮抗活性。吳婷等[7]通過酸解葫蘆巴中性多糖,表明經酸解后形成的產物明顯促進雙歧桿菌、乳酸桿菌的生長,抑制大腸桿菌的生長。

多糖降解一般都采用苯酚-硫酸法[8]、DNS法[9]或者對·OH清除率[10]等抗氧化性為降解程度指標,但是多糖是否得到降解和其降解程度不得而知,MALLS技術是一種測定聚合物分子量一種非常有效的工具,MALLS法測定分子量原理[11]是激光照射到樣品時,會在各個方向產生散射光,在任何方向的光散射強度與相對分子質量和溶液的濃度成正比,適合于混合物及蛋白質等生物大分子的測定,不需要對照品制作標準曲線,具有靈敏、快速,對雜質的包容性強,分析質量范圍大的特點[12]。

因此,本試驗采用硫酸降解繡球菌多糖,在考察硫酸濃度、酸解溫度、反應時間和料液比積等4個單因素對多糖水解度影響的基礎上,通過響應面分析法對酸解工藝進行優(yōu)化,并對酸解前后繡球菌多糖進行多角度激光光散射儀測定,旨在研究酸解制備繡球菌低分子量多糖的優(yōu)化工藝,結合DNS法和多角度激光散射儀共同驗證繡球菌多糖的酸解程度,為繡球菌低分子量多糖進一步的分離純化、結構表征和功能活性開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

繡球菌干品 福清市火麒麟食用菌技術開發(fā)有限公司;濃硫酸、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、苯酚、3,5-二硝基水楊酸、氫氧化鋇、氯化鈉等 分析純,均為國藥集團化學試劑有限公司;試驗中所用的水均為去離子水。

DE-1000 g粉碎機 紅景天公司;SK8210LHC超聲波清洗器 上?？茖С晝x器有限公司;XD-52CS-1旋轉蒸發(fā)器 上海賢德實驗儀器公司;LXJ-ⅡB離心機 上海安亭科學儀器廠;SB-G、SB-806 HQ、SB-804 HQ體積排阻色譜柱、RI-101示差折光檢測器 Shodex公司;DAWN HWLEOSⅡ動態(tài)光散射系統(tǒng) Wyatt公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 繡球菌多糖制備 繡球菌多糖的制備參照崔麗霞等[13]的方法,稍作修改,具體方法如下:

繡球菌→清洗→破碎勻漿→100 ℃熱水浸提6 h→冷卻至室溫→5000 r/min離心15 min→繡球菌粗多糖溶液→旋轉濃縮至原1/3體積(65 ℃、0.095 MPa)→4 ℃醇沉12 h→2倍質量純水復溶→真空冷凍干燥24 h(0.10 mbar,-75 ℃)→繡球菌多糖干粉。

1.2.2 還原糖含量測定 還原糖含量測定采用 DNS法[14]。DNS配方為每100 mL水加18.2 g酒石酸鉀鈉、0.63 g 3,5-二硝基水楊酸、2.1 g氫氧化鈉、0.5 g苯酚,溶液配制后,穩(wěn)定一周后使用。

標準曲線繪制:葡萄糖105 ℃干燥至恒重,準確稱取并配成濃度為1.0 mg/mL的葡萄糖標準溶液,分別吸取0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL葡萄糖標準溶液,不足1.0 mL用去離子水補齊。加入1.50 mL DNS溶液,沸水浴5 min。反應結束,流水冷卻,補水至25.0 mL。在540 nm波長下,以0號管為空白,測定吸光值。以葡萄糖質量濃度為橫坐標,吸光值為縱坐標,繪制標準曲線。得到回歸方程:y=0.5724x-0.0118,R2=0.9993。

1.2.3 繡球菌多糖酸解 取一定量的繡球菌多糖粉末,按一定的料液比加入一定濃度的的稀硫酸,空白組加入等量蒸餾水,在一定溫度下反應一定時間,反應期間定時振蕩混勻。反應結束后,流水冷卻2 min,再加入適量0.5 mol/L NaOH,使溶液pH=7,定容至25 mL容量瓶中,混勻。用上述DNS法,以空白組為對照,540 nm測定吸光值。將水解物中還原糖含量占多糖質量的比值定義為繡球菌多糖酸解的水解度[15],即:

水解度(%)=還原糖含量mg/多糖質量mg×100

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 硫酸濃度對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,在溫度95 ℃、反應時間150 min、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究硫酸濃度分別為0.092、0.280、0.460、0.640、0.830 mol/L對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.2 溫度對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、反應時間150 min、液料比5∶1 mL/g條件下,研究溫度分別為80、85、90、95、100 ℃對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.3 反應時間對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、液料比5∶1 mL/g的條件下,研究時間分別為60、90、120、150、180 min對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.4.4 液料比對水解度的影響 取繡球菌多糖粉50 mg,硫酸濃度0.46 mol/L、溫度95 ℃、反應時間150 min的條件下,研究液料比分別為2.5∶1、5.0∶1、7.5∶1、10.0∶1、12.5∶1 mL/g對繡球菌多糖水解度的影響。

1.2.5 響應面法優(yōu)化酸解工藝 在單因素實驗的基礎上,根據(jù)響應面法中的Box-Behnken設計原理,以硫酸濃度A、反應時間B、料液比C為自變量,多糖水解度(%)為因變量,進行三因素三水平的響應面法分析試驗,確定繡球菌多糖水解的最佳工藝。響應面試驗設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 分子量測定 分子量的測定參照Chen等[16]的方法,并做略微修改。試驗采用SEC-MALLS-RI體系對繡球菌多糖酸解前后分子量進行檢測,該系統(tǒng)主要包括凝膠滲透色譜柱(SEC)、多角度激光光散射檢測器(MALLS)和示差折光檢測器(RI)[17],采用SB-806 M HQ和SB-804 M HQ 兩根柱子串聯(lián),上樣多糖濃度為0.2 mg/mL,進樣量為1 mL,流動相為0.1 mol/L NaCl溶液,流速0.3 mL/min,柱溫箱溫度25 ℃。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 13.0對單因素數(shù)據(jù)結果進行顯著性分析;采用Design-Expert 8.0.6對酸解數(shù)據(jù)進行處理,并對模型做顯著性分析;采用ASTRA 6.1軟件對分子量數(shù)據(jù)進行分析。

圖1 單因素對繡球菌多糖(SCG)水解度的影響Fig.1 Effect of single factor on the degree of hydrolysis of SCG注:圖中不同字母表示差異顯著(P<0.05),相同字母表示差異不顯著(P>0.05)。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

由圖2a可知,硫酸濃度對繡球菌多糖水解度的影響隨著硫酸濃度增大而增大,在硫酸濃度為0.46 mol/L時,繡球菌多糖水解度最高為59.10%,之后隨著硫酸濃度升高,水解度降低。可能是因為高濃度酸在高溫下會使多糖完全水解成單糖[18],且在前期預實驗發(fā)現(xiàn)在硫酸濃度過高時,會出現(xiàn)多糖碳化、溶液變黑等現(xiàn)象。因此,選硫酸濃度為0.46 mol/L為響應面試驗的中心點。

由圖2b可知,繡球菌多糖水解度隨著溫度升高而增加,這可能是因為高溫引起H+的劇烈運動,與多糖的糖苷鍵接觸機會增加,加快糖苷鍵斷裂[19]。可從圖中曲線看到,在95～100 ℃時繡球菌多糖的水解度沒有顯著影響,考慮溫度因素對繡球菌多糖水解的影響,結合實驗結果和實際條件,將繡球菌多糖水解的溫度設為95 ℃。

由圖2c可知,當反應時間小于90 min時,反應不充分,水解度較低。水解度隨著時間增加而增大,在90 min處于最大值61.02%,并在90～150 min處于穩(wěn)定,當反應時間大于150 min時,多糖水解的部分可能在酸催化下繼續(xù)水解成單糖[20],水解度隨著時間增加而減小。故選擇反應時間90 min為中心點。

由圖2d可知,當液料比為5∶1 mL/g時,繡球菌多糖與硫酸充分接觸,水解度最高,為59.58%,當液料比大于5∶1 mL/g時,隨著料液比增加,水解度減小,所以選擇5∶1 mL/g作為響應面的中心點。

2.2 響應面試驗設計及結果

2.2.1 響應面試驗設計結果 在單因素實驗結果的基礎上,采用Box-Behnken法設計三因素三水平的響應面試驗對繡球菌多糖酸解工藝進行優(yōu)化,共有17個試驗點,其中5個為零點以估計誤差,響應面試驗設計與結果見表2。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis variance of regression model

表2 響應面組合設計及結果Table 2 Combination design and results of response surface

2.2.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件對表2的數(shù)據(jù)進行分析,擬合出的二次多項回歸方程為:Y=66.37-0.055A-0.69B+0.66C+0.23AB+1.40AC+0.69BC-6.74A2-6.33B2-5.54C2。本試驗的二項式回歸模擬系數(shù)的顯著性分析見表3。該模型的擬合程度達到極顯著水平(P<0.0001),且該模型失擬項不顯著P>0.05,說明殘差由隨機誤差引起。模型決定系數(shù)R2=0.9846>0.9,說明可以用回歸方程對試驗結果進行分析與預測。從表3可以看出,B、C為顯著(P<0.05),A不顯著;交互項AC為極顯著(P<0.01),AB、BC不顯著,二次項A2、B2、C2均為極顯著(P<0.05)。比較F值大小可以看出影響繡球菌多糖水解度的因素順序為:反應時間(B)>料液比(C)>硫酸濃度(A)。

圖2 硫酸濃度和反應時間對多糖水解度的影響Fig.2 Effect of sulfuric acid concentration and reaction time on degree of hydrolysis of polysaccharides

2.2.3 響應面分析 根據(jù)Design-expert.V8.0.6軟件設計三維響應面來反映最佳區(qū)域,分別固定回歸模型中任一因素處于0水平,代入模型方程考察其余兩個因素間的相互作用,從中選取得率最佳的提取條件。由圖2～圖4可知,三組三維圖的彎曲度都比較大,說明隨著硫酸濃度、反應時間和液料比等因素水平的變化,繡球菌多糖(SCP)水解度也出現(xiàn)顯著性的先升高再逐漸減小的變化,由表3可知對反應時間和料液比對繡球菌多糖水解度影響顯著(P<0.05),但兩個因素間交互作用對響應值沒有顯著的影響(P>0.05)。但硫酸濃度與液料比對多糖水解度的交互影響極顯著,等高線呈橢圓形,三維曲面圖呈拋物線形。

圖3 硫酸濃度和液料比對多糖水解度的影響Fig.3 Effect of sulfuric acid concentration and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

圖4 反應時間與液料比對多糖水解度的影響Fig.4 Effect of reaction time and liquid-to-material ratio on hydrolysis degree of polysaccharide

2.2.4 最佳結果驗證 根據(jù)Design-Expert所得的最佳工藝參數(shù)條件為:硫酸濃度為0.46 mol/L、反應時間85.5 min、液料比6∶1 mL/g,在此條件下,預測多糖水解度為66.40%。根據(jù)實驗具體操作情況,將酸解反應時間定為85 min,其余條件不變,重復三次,最后實際多糖水解度為67.07%±0.77%,與模型預測值的66.40%基本相等,因此該模型預測基本準確,與實際值擬合良好。

2.3 分子量測定結果

SEC-MALLS-RI技術是通過MALLS和RI這兩種檢測器同時測定,通過計算可以直接得到樣品中每個點的絕對分子量及其組分分布,檢測前已用葡聚糖標品對儀器進行校正。繡球菌多糖在酸解前后分子量,如圖5所示,繡球菌多糖含有三個組分,與張傳能[21]的研究結果一致，采用DEAE-52纖維素柱分離繡球菌多糖,發(fā)現(xiàn)其主要有三種組分。酸解后的繡球菌多糖含有兩個組分。

表4 繡球菌多糖酸解前后分子量分布Table 4 Molecular characterization of SCP and SCLP by SEC-MALLS-RI

圖5 繡球菌多糖(A)及其酸解后(B)SEC-MALLS-RI分析Fig.5 SEC-MALLS-RI analysis of SCP(A)and SCLP(B)

通過ASTRA 6.1軟件對結果處理,其對應的分子量如表4所示,由表4可知繡球菌多糖三個組分的數(shù)均分子量分別為2.26×107、1.68×106、2.63×106Da,重均分子量分別為3.32×107、1.79×106、3.18×106Da,z均分子量為:5.47×107、1.94×106、4.45×106Da,三種組分的多分散系數(shù)分別為1.47、1.07、1.20,說明這三種組分具有良好的均一性;酸解后的繡球菌低分子量多糖含兩個組分,數(shù)均分子量分別為2.31×105、4.38×105Da,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,z均分子量為:5.26×105、8.36×105Da,多分散系數(shù)分別為1.40、1.28,酸解后的組分也體現(xiàn)出良好的均一性。繡球菌多糖在硫酸酸解后,分子量明顯降低,其數(shù)量級從107和106降到了105,說明經過酸解后得到一種低分子量繡球菌多糖。

3 結論

本次實驗以水解度為指標研究硫酸對繡球菌多糖降解的影響,通過響應面法優(yōu)化酸解工藝,得到最佳工藝條件為:溫度為95 ℃、硫酸濃度為0.46 mol/L、反應時間85 min、液料比6∶1 mL/g,該條件下多糖水解度為67.07%±0.77%。進一步采用SEC-MALLS-RI系統(tǒng)對繡球菌多糖降解程度進行探究,結果表明,繡球菌多糖在酸解后分子量數(shù)量級從107到了105說明繡球菌多糖得到了有效的水解,且該酸解工藝得到一種低分子量繡球菌多糖;繡球菌多糖在酸解后從3個組分變成2個組分,重均分子量分別為3.25×105、5.61×105Da,具有良好的均一性,為后續(xù)的繡球菌低分子量多糖分離純化和分子量-生物活性關系的研究提供了理論基礎。