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(1.青島農業(yè)大學食品科學與工程學院,山東青島 266000;2.青島農業(yè)大學生命科學學院,山東青島 266000)

杏鮑菇(Pleurotuseryngii)又名刺芹側耳,是近年來開發(fā)栽培成功的集食用、藥用和食療于一體的珍稀食用菌新品種[1]。杏鮑菇富含蛋白質、總糖、膳食纖維,而且還含有銅、鐵、錳、鋅、鈣等大量對人體有益的礦物質及微量元素[2]。杏鮑菇本身含有較多抗氧化活性物質,杏鮑菇抗氧化物是近幾年來才開發(fā)的新型產品[3]。藥用研究表明,杏鮑菇抗氧化活性物質具有降血脂[4]、降膽固醇、增強機體免疫力[5]、抗氧化和抗腫瘤[6]的作用。

近年來,我國食用菌產量持續(xù)增長,其中杏鮑菇產量在2015年達到110萬噸,占同期國內食用菌總產量的3.1%。杏鮑菇在生產加工過程中,會產生大量的杏鮑菇菌柄切削角料,大約平均每生產7噸商品杏鮑菇,就會產生1噸該類副產品[7]。目前,杏鮑菇菌柄切削角料主要用作飼料和肥料,利用率不高,環(huán)境污染嚴重[8]。從營養(yǎng)角度分析,杏鮑菇柄與杏鮑菇子實體基本毫無差別,其低廉的價格及優(yōu)異的抗氧化性,使之非常適用于開發(fā)具有優(yōu)良抗氧化性能的食用菌深加工產品[9]?？聵非鄣萚10]利用酶法微波輔助從杏鮑菇殘渣中提取多糖抗氧化活性物質,但其選用酶較為單一;Mishra等[11]研究了不同食用菌種的抗氧化特性及提高杏鮑菇的生物轉化效率,而杏鮑菇抗氧化活性物質的自由基清除活性要高于其它菌種;鄭藝梅等[12]研究了不同粒度杏鮑菇菌柄基部粉體氨基酸組成特性、營養(yǎng)價值及總糖含量,表明杏鮑菇柄營養(yǎng)價值與杏鮑菇子實體基本無差別。多糖的提取在杏鮑菇深加工領域占主導地位,而多糖提取后的蛋白質和膳食纖維副產物等尚未被開采,造成資源浪費和環(huán)境污染。這些方面使得杏鮑菇綜合利用率低,加工產品品種少,技術含量低[13]。因此,以杏鮑菇的加工廢棄物杏鮑菇柄為原料,制備杏鮑菇柄抗氧化肽,更容易被消化吸收,具有較高的生物活性,可應用在食品深加工領域中實現資源的充分利用,使杏鮑菇的營養(yǎng)價值和藥用價值得到充分的發(fā)揮。

本文以杏鮑菇的加工廢棄物杏鮑菇柄為原料,通過對杏鮑菇柄抗氧化肽的制備,研究其多肽的抗氧化活性與穩(wěn)定性分析,為食用菌副產品的開發(fā)利用提供一定數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮杏鮑菇柄 青島市城陽批發(fā)市場;木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、風味蛋白酶、胰蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基 梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司;磷酸(GR)、乙酸(AR)、鄰苯三酚(AR)、FeCl3(AR) 國藥集團化學試劑有限公司;無水乙醇、丙酮、冰醋酸 萊陽市康德化工有限公司;磷酸氫二鈉、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司;三氯乙酸 天津市致遠化學藥劑有限公司;磷酸二氫鈉 天津市巴斯夫化工有限公司。

CU600A型恒溫水槽 上海?，斣囼炘O備有限公司;E0M210型精密電子分析天平 奧豪斯國際貿易(上海)有限公司;TGL-16M型高速臺式冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司;UV-2000型紫外可見分光光度計 尤尼克(上海)儀器有限公司;UVS-1型渦旋機 北京優(yōu)晟聯合科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杏鮑菇柄多肽的制備 粗蛋白的提取:稱取10 g杏鮑菇柄,加50 mL 水打漿,用1 mol/L NaOH溶液將pH調至11.0,4 ℃ 6000 r/min離心10 min,取上清液,回調pH到7.0。加入90%的乙醇進行沉淀,4 ℃ 6000 r/min離心取上清,旋轉蒸發(fā)儀50 ℃將上清液中乙醇蒸出,得杏鮑菇柄蛋白粗提液。

配制一定濃度的杏鮑菇柄蛋白液,在選用酶最適溫度和pH的條件下,添加一定量的酶,加熱水解1.5 h,并在沸水浴中滅酶10 min,最后在6000 r/min下離心10 min取上清液[14],得杏鮑菇柄粗抗氧化肽。

1.2.2 單因素實驗

1.2.2.1 蛋白酶的篩選 選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶[15],在加酶量6000 U/g以及其最適pH及最適溫度(表1)下水浴酶解1.5 h,同上1.2.1,所得上清液即為杏鮑菇柄粗抗氧化肽。以 DPPH自由基清除率為指標,確定杏鮑菇柄酶解的最佳蛋白酶。

表1 酶的最適pH和最適溫度Table 1 Optimal pH and temperature of enzymes

1.2.2.2 加酶量的確定 液料比為20∶1 mL/g的條件下,添加不同濃度(2000、4000、6000、8000和10000 U/g)的堿性蛋白酶,pH9.0、45 ℃下水解1.5 h,以 DPPH自由基清除率為指標,確定最適加酶量。

1.2.2.3 酶解時間的影響 在液料比為20∶1 mL/g的條件下,添加6000 U/g的堿性蛋白酶,pH9.0、45 ℃下水解(0.5、1.0、1.5、2.0和2.5 h),研究不同加酶量對酶解產物DPPH自由基清除率的影響。

1.2.2.4 液料比的影響 在不同的液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)下,添加6000 U/g的堿性蛋白酶,pH9.0、45 ℃下水解1.5 h,研究不同液料比對酶解產物DPPH自由基清除率的影響。

1.2.3 響應面試驗 單因素實驗的基礎上,以液料比(A)、加酶量(B)、酶解時間(C)為變量,以DPPH自由基清除率(Y)為響應值,進行三因素三水平的響應面實驗[16]。試驗因素與水平設計見表2所示,數據分析軟件采用Design-Expert 8.0.5。

表2 試驗因素水平編碼Table 2 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4 抗氧化活性研究

1.2.4.1 DPPH自由基清除率的測定 依次加入4 mL DPPH溶液和提取液,再加入無水乙醇至10 mL,混勻在517 nm處測吸光值,吸光值記為Ai,再避光保存30 min后測吸光值,記為Aj,對照為只加DPPH的乙醇溶液,其吸光值記為Ac。按下式計算自由基清除率(K)[17]:

K(%)=[1-(Ai-Aj)/Ac]×100

式(1)

1.2.4.2 還原能力的測定 依次加入2.5 mL磷酸緩沖液、鐵氰化鉀溶液混合均勻,水浴30 min,取出加入三氯乙酸,混勻,離心10 min,取上清液加入2.5 mL二次水和三氯化鐵溶液,混勻后用分光光度計在700 nm下測定吸光度[18]:

還原能力(%)=[1-(Ai-Aj)]/Ao×100

式(2)

式中:實驗組(Ai);對照組(Ao);空白組(Aj)。

1.2.4.3 羥基自由基清除能力的測定 試管中依次加入3.5 mL去離子水,0.5 mL水楊酸-乙醇溶液,0.5 mL樣品,0.5 mL FeCl2溶液,5 mL H2O2,搖勻,在510 nm處測定吸光度[19]:

羥自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A3]×100

式(3)

式中:A1-樣品的吸光度值;A2-蒸餾水替代9 mmoL/L的FeCl2的吸光度值;A3-去離子水替代樣品溶液的吸光度值。

1.2.4.4 超氧陰離子自由基清除能力測定 采用鄰苯三酚自氧化法[20]。以等體積0.01 mol/L HCl代替鄰苯三酚為空白調零,對照組為等體積二次水代替樣品。對照品為VC:

清除率(%)=(A0-A)/A0×100

式(4)

式中,A0-對照組的吸光度值;A-樣品組的吸光度值。

1.2.5 穩(wěn)定性研究

1.2.5.1 溫度對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 配制濃度為10%的杏鮑菇柄抗氧化肽溶液,放置于20、40、60、80、100 ℃的恒溫水浴中處理1 h后[21],再冷卻至室溫后測定DPPH清除活性保持率。

1.2.5.2 pH對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 配制濃度為10%的杏鮑菇柄抗氧化肽溶液,將其pH分別調為2、4、6、8、10、12,在室溫下放置1 h后,測定DPPH清除活性保持率。

1.2.5.3 金屬離子對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 配制濃度為10%的杏鮑菇柄抗氧化肽溶液,向溶液中加入1 mL 500 μg/mL的K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+等金屬離子溶液,在室溫下放置1 h后,測定DPPH清除活性保持率。

1.2.5.4 食品原料對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響 配制濃度為10%的杏鮑菇柄抗氧化肽溶液,向溶液中分別添加NaCl、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖等食品原料,使其最終濃度均為5%,室溫下放置1 h后,測定DPPH清除活性保持率。

DPPH自由基清除活性保持率(%)=A2/A1×100

式(5)

1.3 數據處理

每次實驗設3個平行,取平均值,數據采用Sigma Plot 10.0軟件和Design Expert 8.06軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 蛋白酶的篩選 各蛋白酶對杏鮑菇柄粗抗氧化肽清除DPPH自由基能力如圖1所示。圖1可以看出,堿性蛋白酶酶解水解度最高,水解1.5 h,其DPPH自由基清除率達40.38%,其次是風味蛋白酶,達32.17%。因此,選擇堿性蛋白酶進行水解,這一結果與國外采用的商業(yè)堿性酶作為水解蛋白酶的研究結果一致[23]。

圖1 蛋白酶的篩選結果Fig.1 Screening results of protease

2.1.2 加酶量的確定 增大酶濃度可以增加酶與底物之間結合的幾率,從而增強酶解程度[24]。圖2所示,在酶添加量為2000 U/g時,DPPH自由基清除率僅為26.75%,隨加酶量的增加,在6000 U/g時,DPPH自由基清除率達到最大值42.67%,隨后呈現下降的趨勢。酶添加量過高導致DPPH自由基清除率下降,可能是因為活性較好的抗氧化肽被進一步酶解為不具活性的氨基酸或小分子肽,從而導致抗氧化活性降低[25]。由此可見,為得到最佳效果的DPPH自由基清除率,故選擇6000 U/g為本實驗的最佳酶用量。

圖2 加酶量對抗氧化活性的影響Fig.2 Effect of enzyme amount on antioxidant activity

2.1.3 酶解時間的影響 隨著酶解時間的延長,酶解得到的肽段和游離氨基酸構成比例有所不同,酶解物對DPPH自由基清除率也有所變化[26]。由圖3所示,隨著時間的增加,DPPH自由基清除率逐漸增大,在酶解時間為1.5 h時達到最大值,為40.97%。由于隨著酶解時間的增加,具有抗氧化作用的多肽被切斷,導致失去抗氧化活性并引起DPPH自由基清除能力的下降[27],當酶解2.5 h時DPPH自由基清除率僅為29.12%。因此,最佳酶解時間為1.5 h。

圖3 酶解時間對抗氧化活性的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on antioxidant activity

2.1.4 不同液料比的影響 過高的底物濃度易造成水解液黏度增大,降低了底物與蛋白酶的擴散,對蛋白質鏈斷裂反應有抑制作用。在底物濃度一定的時候,理論上酶分子越多,則酶與底物之間作用越頻繁。隨著底物濃度的減少,會降低蛋白酶和作用底物的碰撞概率[28-29]。當底物濃度小到一定程度時,酶的數量就趨于過剩,單位時間內一部分酶分子不與底物結合,造成蛋白質鏈斷裂反應變緩慢。由圖4可知,清除DPPH自由基的能力隨液料比的增大呈先增大后減小的趨勢,液料比在20∶1 mL/g處清除率到達最大值,清除率為40.02%。因此選擇20∶1為最佳液料比。

圖4 液料比對抗氧化活性的影響Fig.4 Effect of liquid-to-material ratio on antioxidant activity

2.2 響應面試驗結果及分析

2.2.1 響應面試驗設計結果 根據上述單因素的實驗結果,以DPPH自由基清除率為響應值,利用design-expert 8.0.5響應面軟件設計了3因素3水平的響應面法實驗,共有17個實驗點,其中13個為分析因點,4個為零點以估計誤差,進行響應面優(yōu)化實驗,響應面試驗設計結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計結果Table 3 Design and results of response surface methodology

2.2.2 響應面回歸模型的建立與分析 以DPPH自由基清除率作為響應值(Y),通過design-expert 8.0.5響應面軟件對試驗結果進行響應面分析,對表3數據進行方差分析后得到其線性回歸方程如下:

Y=55.58-4.44A-0.90B+1.17C+1.17AB+1.20AC+1.97BC-6.07A2-11.54B2-2.66C2對回歸模型方差分析結果如表3所示:

表4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Regression analysis results of variance analysis

由回歸方程和表4的方差分析結果可以看出,所得Y的回歸方程極顯著(P<0.01),失擬檢驗不顯著(P>0.05),說明該方程擬合良好,實驗誤差小。該模型的修正系數由R2=0.9724確定,表明響應值變化的97.24%可以由方程中的3個因子解釋。說明采用響應面法設計所得的回歸模型有效,適用于堿性蛋白酶酶解制備杏鮑菇柄多肽實驗的理論預測。

該模型中,各響應因素影響程度依次為:A>B>C,即液料比>加酶量>酶解時間。液料比對酶解液DPPH自由基清除率的影響顯著,而酶解時間與加酶量對酶解液DPPH自由基清除率的影響不顯著。

由Design-expert 8.0.5響應面分析軟件結果得出酶解法制備杏鮑菇柄多肽的最佳條件為:堿性蛋白酶加酶量為5846 U/g,酶解時間為1.59 h,液料比為16.06∶1 mL/g,DPPH自由基清除率為56.5%。按照該條件進行DPPH自由基清除率的驗證性實驗,通過3次驗證試驗發(fā)現平均清除率為55.52%±0.98%,與理論值的相對誤差為1.89%[30],與上述結果基本一致,表明本實驗優(yōu)化結果可信。優(yōu)化條件的結果見圖5，發(fā)現等高線稀疏，兩兩因素交互作用對響應值的影響不顯著。

圖5 各因素交互作用對DPPH自由基清除能力的影響Fig.5 Effects of interaction of various factors on DPPH free radical scavenging ability

2.3 杏鮑菇柄多肽的抗氧化活性分析

表5 抗氧化指標結果(%)Table 5 Antioxidant index results(%)

2.4 杏鮑菇柄多肽的穩(wěn)定性分析

2.4.1 溫度對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響 食品加工過程中通常會涉及到溫度的變化,杏鮑菇柄多肽溶液在20～100 ℃下恒溫水浴處理后,其抗氧化活性的變化情況如圖6所示。隨著溫度的升高DPPH自由基清除率下降。杏鮑菇柄的酶解產物在溫度超過40 ℃后,抗氧化活性保持率下降明顯,當處理溫度升高到100 ℃時,抗氧化活性的損失比較明顯,這說明高溫處理會使得多肽中的氨基酸發(fā)生降解作用。

圖6 溫度對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of temperature on the stability of antioxidant peptides in Pleurotus eryngii stalk

2.4.2 pH對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響 杏鮑菇柄多肽溶液在pH2～12的范圍內處理,其抗氧化活性的變化情況如圖7所示:當pH為中性時,DPPH自由基清除活性保持率幾乎沒有影響。而強酸或強堿性環(huán)境都會影響抗氧化活性,且強堿性環(huán)境影響更為顯著。堿性蛋白酶的酶解產物在pH為12時,其DPPH自由基清除活性保持率為83.65%。由此可見,堿性條件下對的杏鮑菇柄多肽抗氧化活性會有顯著影響,猜測可能是因為在堿性條件下,多肽發(fā)生消旋作用而使肽鏈的構象發(fā)生變化,從而影響其活性[35]。

圖7 pH對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of pH on stability of antioxidant peptides from Pleurotus eryngii stalk

2.4.3 金屬離子對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響 由于含蛋白水解物的營養(yǎng)食品在加工中經常要與金屬接觸,故金屬離子對多肽穩(wěn)定性的影響非常重要。一些蛋白酶在金屬離子的作用下可以發(fā)生構象的轉變,由此多肽分子對不同的金屬離子刺激響應程度不同[36]。杏鮑菇柄多肽溶液中添加500 μg/mL的K+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Cu2+等金屬離子,抗氧化活性的變化情況如圖8所示:金屬離子對堿性蛋白酶酶解產物的活性保持率持有不同程度的影響,對堿性蛋白酶的酶解產物影響大小依次為:Cu2+>Zn2+>Ca2+>Mg2+>K+。Thanonkaew等[37]報道不同濃度、種類和化合價的金屬離子對烏賊肌肉影響不同,如添加 Fe2+會加速烏賊肌肉的脂肪氧化,而Cu2+和Cd2+則對其無顯著影響,與Thanonkaew報道的對烏賊肌肉影響結果不同,可能是由于Cu2+、Zn2+和杏鮑菇柄多肽之間存在特殊的化學力作用,導致杏鮑菇柄多肽抗氧化活性的降低?？傮w來說,多肽對Cu2+、Zn2+非常敏感,而對K+、Mg2+而言,活性保持率雖有所下降,但下降不明顯。因此在杏鮑菇柄多肽的加工使用和貯藏中要避免與含Cu2+、Zn2+的材料接觸。

2.4.4 食品原料對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響 杏鮑菇柄多肽溶液中添加5.0%的NaCl、葡萄糖、淀粉、蔗糖、乳糖等食品原料,抗氧化活性的變化情況如圖9所示:添加質量分數為5.0%的NaCl對酶解產物的活性影響很小,酶解產物的活性保持率依然接近100%。與杏鮑菇柄多肽溶液相比,添加質量分數為5.0%的葡萄糖對杏鮑菇柄肽的抗氧化活性下降明顯,杏鮑菇柄多肽酶解產物的活性保持率為82.19%(圖9)。而添加質量分數為5.0%的蔗糖、淀粉以及乳糖對酶解產物的抗氧化活性略微影響,DPPH自由基清除活性保持率下降不明顯。Benjakul等[38]研究表明半乳糖與豬血漿蛋白產生的反應產物較葡萄糖具有更大的DPPH自由基清除活性。牛改改等[39]發(fā)現,與乳糖相比,半乳糖、葡萄糖對牡蠣蛋白肽的功能特性和抗氧化性改善效果較好,與本實驗研究結果一致。可能是因為乳糖與杏鮑菇柄多肽糖基化反應產物的溶解性更好,促進了氫原子或自由基中間體的形成,進而與DPPH·結合形成穩(wěn)定分子結構,從而使DPPH自由基清除活性保持率下降不明顯。由此可見相較于其它食品原料對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響,質量分數為5.0%的葡萄糖對杏鮑菇柄多肽穩(wěn)定性的影響最為明顯。

圖9 食品原料對杏鮑菇柄抗氧化肽穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effect of food materials on the stability of antioxidant peptides in Pleurotus eryngii stalk

3 結論

研究表明,選用堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、風味蛋白酶五種酶進行酶解,堿性蛋白酶抗氧化活性效果明顯。單因素實驗與響應面優(yōu)化試驗確定最優(yōu)工藝條件為:堿性蛋白酶加酶量為5846 U/g,酶解時間為1.59 h,液料比為16.06∶1,DPPH自由基清除率為55.52%±0.89%。杏鮑菇柄抗氧化肽的穩(wěn)定性研究表明,杏鮑菇柄多肽在溫度超過40 ℃時,活性保持率明顯降低。強酸環(huán)境和強堿環(huán)境對多肽的抗氧化活性均有影響,強堿性環(huán)境下影響更顯著;金屬離子對杏鮑菇柄多肽溶液的抗氧化活性有很大影響,Cu2+對水解產物的DPPH自由基清除率影響最顯著,K+對水解產物的影響相對較小;與杏鮑菇柄多肽溶液相比,添加質量分數為5.0%的NaCl對水解產物的抗氧化活性沒有顯著著影響,添加5.0%的葡萄糖使杏鮑菇柄肽的抗氧化活性下降明顯,5.0%的蔗糖和淀粉稍微影響水解產物的抗氧化活性。結果顯示堿性蛋白酶進行酶解制備得到的抗氧化肽,其抗氧化活性比用風味蛋白酶效果更好,因此在以后的生產中可以選用堿性蛋白酶進行酶解制備杏鮑菇柄抗氧化肽,同時在儲存過程中要盡量避免與高溫、強酸強堿環(huán)境及金屬離子等因素接觸。研究結果對于進一步開發(fā)和利用杏鮑菇柄資源提供一定的技術支持。