宋 樂,王英麗,吉日木圖

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010000)

膠原蛋白是動物組織中的一種纖維狀蛋白質(zhì),是構成細胞外基質(zhì)的主要成分,占動物體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的30%左右[1],對機體和臟器起著支持、保護、結合與形成間隔作用,其特征結構是三螺旋結構,使膠原蛋白保持其穩(wěn)定結構,同時還具有良好的生物相容性、可降解性和低抗原性等[2]。因此,膠原蛋白作為可食性或可降解膠原膜[3]、促進肌肉組織愈合的傷口敷料[4]、保健食品等被廣泛應用于皮革、制藥、生物醫(yī)學與食品等行業(yè)領域中。目前國內(nèi)對水產(chǎn)動物等膠原資源關注點較多,但其提取獲得的膠原蛋白存在熱穩(wěn)定性與生物力學性能差等問題,在一定程度上限制其應用[5-6]。此外,牛、羊、豬的皮、跟腱等也是膠原蛋白提取的主要來源,而對駱駝資源膠原蛋白的研究則較少。

內(nèi)蒙古自治區(qū)是國內(nèi)主要的養(yǎng)駝基地之一,據(jù)中國統(tǒng)計年鑒顯示,2018年我國約有32.3萬峰雙峰駝,我區(qū)約有16.9萬峰。駱駝肉、乳、皮、絨與骨均具一定經(jīng)濟價值,其胎盤、乳、脂、瘤胃內(nèi)容物等部位科研價值極高[7]。相關研究表明,駱駝掌營養(yǎng)價值高,富含膠原蛋白,是豐富的膠原蛋白潛在資源[8]。駱駝掌傳統(tǒng)加工的方式主要以烹調(diào)為主,為擴大駱駝掌的利用范圍,增加駱駝的附加值,本文以駱駝掌為實驗原料,選用胃蛋白酶從駱駝掌中提取膠原蛋白,確定其最佳提取工藝參數(shù)。經(jīng)過鹽析純化后,獲得駱駝掌膠原蛋白粗品,并與牛蹄膠原蛋白進行性質(zhì)比較,以期為動物膠原蛋白資源的開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮駱駝掌 購于阿拉善盟左旗屠宰場,剔骨洗凈在-20 ℃下冷藏備用;羥脯氨酸標準品、牛蹄膠原蛋白 北京索萊寶生物科技有限公司;胃蛋白酶(1∶10000;800～2500 U/mg) 美國Sigma公司;標準蛋白Marker 上海伯樂(Bio-Rad)公司;其他試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JJ-2組織搗碎機 常州賽普實驗儀器廠;78-1磁力加熱攪拌器 常州迅生儀器有限公司;鼓風干燥箱 上海博迅實業(yè)有限公司;SP-723P可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;SCIENTZ-10N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;2XZ-2型旋片式真空泵 臨海市永昊真空設備有限公司;紫外可見分光光度計 日立高新技術公司;BPHJS-060A高低溫交變濕熱試驗箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原蛋白提取工藝 新鮮冷凍駱駝掌→預處理→酶解→離心→鹽析→離心→透析→冷凍干燥→膠原蛋白

將解凍后的駱駝掌剪成小塊,在10%正丁醇中浸泡脫脂24 h,離心后棄上清,沉淀去除表面的正丁醇。隨后浸泡在0.1 mol/L的NaOH溶液中24 h,以除去雜蛋白,堿處理后的駱駝掌用去離子水沖洗至中性備用。取脫脂除雜蛋白后的樣品,以一定的料液比(w/v)加入乙酸溶液,再加入一定量的胃蛋白酶酶解反應一定時間,10000 r/min離心20 min,保留上清酶解液,測定其膠原蛋白含量。在離心所得上清酶液中加入NaCl至最終濃度為0.9 mol/L進行鹽析,取沉淀用0.5 mol/L乙酸溶解后,依次在0.1 mol/L的乙酸溶液和蒸餾水中透析24 h,每6 h更換一次透析外液,離心后進行冷凍干燥得粗品膠原蛋白,妥善保存[9]。膠原蛋白提取所有操作在低于10 ℃條件下進行。

1.2.2 單因素實驗 以駱駝掌膠原蛋白提取率為指標,采用1.2.1的方法,固定提取時間為36 h,加酶量3%,乙酸濃度0.50 mol/L,料液比為1∶15 g/mL進行實驗。

設定變量因素的水平依次為提取時間(12、24、36、48、60、72 h)、加酶量(1%、2%、3%、4%、5%、6%)、乙酸濃度(0.25、0.50、0.75、1.00、1.50 mol/L)、料液比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL)進行單因素實驗。

1.2.3 正交試驗 在單因素結果的基礎上,以提取時間、加酶量、乙酸濃度、料液比為影響因素,各取三個水平,采用L9(34)正交試驗設計,以膠原蛋白提取率為指標,確定駱駝掌膠原蛋白的最優(yōu)提取工藝。駱駝掌膠原蛋白的試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4 膠原蛋白提取率 采用比色法[10]測定羥脯氨酸標準曲線。羥脯氨酸質(zhì)量濃度范圍0～2 μg/mL,以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標制作標準曲線,得方程Y=0.1935X+0.0318(R2=0.9997)。

按照1.2.1的方法進行提取,移取離心后的上清酶解液1 mL,加入3 mL的6 mol/L鹽酸在105 ℃下完全水解5 h[11],用分光光度法測定酶解液中羥脯氨酸含量,通過標準曲線方程結合式(1)與式(2),計算膠原蛋白的含量并計算其提取率。

膠原蛋白含量=羥脯氨酸含量×7.1

式(1)

式(2)

式中:X表示酶解液中膠原蛋白含量,μg/mL;Y表示原料中膠原蛋白的含量,為99.63 μg/mL;7.1為羥脯氨酸換等成膠原蛋白系數(shù)。

1.2.5 紫外光譜掃描 取最優(yōu)條件下制備的粗品膠原蛋白,用0.5 mol/L的乙酸配制0.5 mg/mL的膠原蛋白溶液[12],用紫外分光光度計在波長200～400 nm進行掃描,波長間隔為1 nm,蒸餾水作空白對照。

1.2.6 SDS-PAGE分析 將樣品以0.5 mg/mL的濃度溶于0.5 mol/L的乙酸溶液,混合物與上樣緩沖液混勻后于100 ℃的水浴加熱3～5 min,冷卻后以10 μL上樣量進行上樣。采用8%的分離膠和5%的濃縮膠[13]。直壓恒流電源,濃縮膠80 V,進入分離膠后調(diào)整為120 V,電泳時間為2～3 h。

1.2.7 吸油性分析 準確量取2 mL食用級花生油,放置于5 mL刻度離心管中,再稱取0.3 g樣品(駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白),加入離心管中,用細棒攪拌1 min,靜置30 min,在轉(zhuǎn)速為10000 r/min離心10 min,記下游離油的體積[14],則樣品的吸油性為:

式(3)

1.2.8 吸濕性分析 精確稱取樣品0.5 g(駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白),置于干燥的稱量瓶中,放入密閉恒溫恒濕培養(yǎng)箱,溫度為30 ℃,濕度為80%,每隔一段時間精確測定樣品的質(zhì)量,同時用甘油作對照,重復做3組平行試驗[15-16],計算樣品和甘油的吸濕率,以時間為橫坐標,吸濕率為縱坐標作圖。吸濕率計算公式如下:

式(4)

式中:X表示吸濕率,%;mt表示t小時后樣品或甘油的質(zhì)量,g;m0表示試驗開始時樣品或甘油的質(zhì)量,g。

1.2.9 保濕性分析 精確稱取樣品0.5 g(駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白),置于稱量瓶中,同時在稱量瓶中加入樣品質(zhì)量的10%蒸餾水,放入含有干燥劑的密閉干燥器中,每隔一段時間精確測定樣品的質(zhì)量,同時用甘油作對照[15-16],重復做3組平行試驗,計算樣品和甘油的保濕率,以時間為橫坐標,保濕率為縱坐標作圖。保濕率計算公式如下:

式(5)

式中:Y表示保濕率,%;m0表示試驗開始時樣品或甘油的質(zhì)量,g;mt表示t小時后樣品或甘油的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有指標均重復3次,采用Excel 2013和Graphpad-Prism 6.01進行作圖,用SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)處理。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 提取時間對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響 由圖1可知,隨著提取時間的延長,駱駝掌膠原蛋白的提取率呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(P<0.05),在提取時間為48 h時,駱駝掌膠原蛋白提取率達到最高,這表明隨著提取時間的延長,駱駝掌中膠原蛋白與胃蛋白酶充分接觸,利于駱駝掌中膠原蛋白溶出。當提取時間超過48 h時,提取液中膠原蛋白達到飽和狀態(tài),隨著提取時間繼續(xù)延長,膠原蛋白含量顯著下降(P<0.05),這可能是因為提取出來的膠原蛋白部分被胃蛋白酶酶解,此測定結果與宋正規(guī)等[17]結果一致。由此,試驗初步選擇駱駝掌膠原蛋白提取時間范圍為24～48 h。

圖1 提取時間對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on collagen yield of camel palm注:圖中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),圖2～圖4同。

2.1.2 加酶量對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響 由圖2可以看出,隨著胃蛋白酶加酶量的增加,駱駝掌膠原蛋白提取率呈先升后降趨勢(P<0.05)。胃蛋白酶加酶量從1%增至5%時,膠原蛋白提取率增長速度較快,當超過5%時,可能是由底物不足影響反應的繼續(xù)進行,增加加酶量,提取率不再增長,而加酶量過高,可能會過度酶解,使小分子的蛋白片段斷鏈為游離的氨基酸,導致膠原蛋白提取率顯著下降[18-19],因此,初步選擇駱駝掌膠原蛋白提取加酶量的范圍為3%～5%。

圖2 加酶量對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme concentration on collagen yield of camel palm

2.1.3 乙酸濃度對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響 由圖3可知,隨著乙酸濃度的增加,駱駝掌膠原蛋白的提取率也增加,在濃度超過1.00 mol/L時,提取率開始顯著下降(P<0.05),可能因為乙酸濃度過高,駱駝掌蛋白穩(wěn)定性下降,膠原蛋白肽鏈極易斷鏈,產(chǎn)生大量的肽鏈片段[20],導致膠原蛋白的提取率下降,因此,初步選擇駱駝掌膠原蛋白提取的乙酸濃度為0.50～1.00 mol/L。

圖3 乙酸濃度對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of acetic acid concentration on collagen yield of camel palm

2.1.4 料液比對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響 由圖4所示,駱駝掌膠原蛋白的提取率受料液比影響較大(P<0.05)。隨著料液比的增大,駱駝掌膠原蛋白的提取率呈顯著提高的趨勢。當料液比達到1∶15 g/mL時,駱駝掌膠原蛋白提取率最高,繼續(xù)增大料液比,提取率沒有顯著變化,因此,初步選擇駱駝掌膠原蛋白提取的料液比為1∶15～1∶25 g/mL。

2.2 駱駝掌膠原蛋白提取工藝優(yōu)化結果

結合表2和表3可知,提取時間、加酶量、乙酸濃度、料液比對駱駝掌膠原蛋白的提取率均有極顯著影響,其中提取時間影響最大,乙酸濃度影響最小。正交試驗優(yōu)化駱駝掌膠原蛋白的提取工藝有兩種組合,即A3B2C1D1(D2),按照兩種工藝組合做驗證試驗,結果表明兩種方案的提取率相近,沒有顯著差異,考慮到試驗成本,故選取方案:A3B2C1D1,即提取時間48 h,加酶量4%,乙酸濃度0.50 mol/L,料液比1∶15 g/mL,此條件下提取率為30.33%±0.19%。

表3 主體間效應的檢驗Table 3 Test of intersubject effect

圖4 料液比對駱駝掌膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of solid-to-liquid ratio on collagen yield of camel palm

表2 正交試驗設計與結果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.3 紫外掃描圖譜分析

由于膠原蛋白中存在羰基、羧基和酰胺基等發(fā)色基團,使其能吸收一定波長的紫外光。一般來說,芳香族氨基酸殘基會在250～280 nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰;氨基酸殘基、氫鍵或與螺旋等構象相關的次級鍵會在210～250 nm波長范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰;蛋白質(zhì)分子中的肽鍵及某些與蛋白質(zhì)構象相關因素會在210 nm波長以下范圍內(nèi)產(chǎn)生吸收峰[21-22]。由圖5可知,駱駝掌膠原蛋白的最大吸收峰出現(xiàn)在232 nm處,與相關研究的結果相近[23-24],是膠原蛋白三股螺旋結構的特征吸收峰,可初步判定本試驗的提取物為膠原蛋白。

圖5 駱駝掌膠原蛋白的紫外掃描圖譜Fig.5 Ultraviolet scan of collagen of camel paw

2.4 SDS-PAGE圖譜分析

由圖6所示,與Marker對比,駱駝掌膠原蛋白中含有1條β鏈和至少2條α鏈,在高于250 kDa處的條帶是Ⅰ型膠原蛋白α鏈的三聚體,即γ鏈;在200 kDa處是α鏈二聚體,即β鏈;130 kDa處為α1鏈;約110 kDa處是α2鏈,與王曉軍等[23]結果一致。因此,判斷提取物為結構較為完整的Ⅰ型膠原蛋白。研究表明,高分子質(zhì)量的γ和β鏈含量越高,膠原蛋白的凝膠強度就越低[25],駱駝掌膠原蛋白的γ和β鏈含量較少,表明駱駝掌膠原蛋白的凝膠性較好。駱駝掌膠原蛋白的α1帶的強度約為α2帶的2倍,表明駱駝掌膠原蛋白分子可能由兩條α1鏈和一條α2鏈構成,而由于α1-和α3-在單相垂直電泳中無法分離,α1鏈中可能含有α3鏈[26],因此駱駝掌膠原蛋白分子也可能由α1鏈、α2鏈和α3鏈各一條構成[27]。

圖6 SDS-PAGE凝膠電泳分析圖譜Fig.6 SDS-PAGE patterns of collagen

2.5 駱駝掌膠原蛋白、牛蹄膠原蛋白的吸油性對比分析

駱駝掌蛋白質(zhì)與牛蹄蛋白質(zhì)含量相近,且市面上的哺乳動物膠原蛋白產(chǎn)品多來源于牛蹄,由此試驗選擇牛蹄膠原蛋白比較分析駱駝掌膠原蛋白的性能。駱駝掌膠原蛋白吸油性測定結果表明,駱駝掌膠原蛋白的吸油值為(6.22±0.44) mL/g,同時測得牛蹄膠原蛋白的吸油值為(10.68±0.26) mL/g,駱駝掌膠原蛋白的吸油性弱于牛蹄膠原蛋白的吸油性。

2.6 駱駝掌膠原蛋白、牛蹄膠原蛋白的吸濕性和保濕性對比分析

膠原蛋白富含親水性的甘氨酸、羥脯氨酸、羥賴氨酸等天然保濕因子,性質(zhì)溫和,不刺激皮膚和眼睛,它與皮膚表面的蛋白質(zhì)結合,可補充人體流失的膠原蛋白、氨基酸,能涵養(yǎng)皮膚水分,使皮膚有良好的親合性[28]。從圖7和圖8可看出,隨著時間延長,駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白的吸濕率和保濕率曲線變化相似。與甘油的吸濕率和保濕率對比,駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白明顯均弱于甘油,且駱駝掌膠原蛋白的吸濕性和保濕性均比牛蹄膠原蛋白好。當放置達到48 h時駱駝掌膠原蛋白與牛蹄膠原蛋白的吸濕率分別為8.15%和5.79%,其保濕率分別為50.15%和43.17%。膠原蛋白的吸濕率和保濕率與其暴露的親水基團有關[29],由上述試驗結果可推測出駱駝掌膠原蛋白和牛蹄膠原蛋白的親水基團存在差異。

圖7 駱駝掌膠原蛋白、牛蹄膠原蛋白和甘油的吸濕性曲線Fig.7 Hygroscopic curve of camel palm collagen,bovine tendon collagen and glycerol

圖8 駱駝掌膠原蛋白、牛蹄膠原蛋白和甘油的保濕性曲線Fig.8 Moisture retention curve of camel palm collagen,bovine tendon collagen and glycerol

3 結論

本試驗優(yōu)化駱駝掌膠原蛋白的提取工藝最優(yōu)組合為提取時間48 h、胃蛋白酶加酶量為4%、乙酸濃度為0.50 mol/L、料液比為1∶15 g/mL,得到駱駝掌膠原蛋白提取率為30.33%±0.19%。通過紫外光譜、垂直電泳分析駱駝掌膠原蛋白的最大吸收峰為232 nm,符合I型膠原蛋白特征,且含有α1、α2、β鏈,保留了完整的三螺旋結構。與牛蹄膠原蛋白相比,試驗結果顯示駱駝掌膠原蛋白的吸濕性和保濕性優(yōu)于牛蹄膠原蛋白,且其吸油性弱于牛蹄膠原蛋白。為駱駝掌膠原蛋白的研究應用提供了一定的實驗基礎,但如何更高效的提取駱駝掌膠原蛋白,進一步研究其功能特性及應用范圍,這些問題的解決將成為未來駱駝掌膠原蛋白研究的重點。