劉媛潔1,張 良,*,胡歡平1,嚴(yán)美婷

(1.江西醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校,江西上饒 334000;2.江西省食品發(fā)酵研究所,江西宜春 336000)

果膠(pectin)是一種由聚半乳糖醛酸組成的高分子多糖物質(zhì)[1-2],是一種膳食纖維,不被人體所吸收,具有多種生理功效,如改善便秘、降血糖、美容養(yǎng)顏、排除體內(nèi)毒素等,在工業(yè)上還可用于增稠劑、乳化劑等[3-5]。天然的果膠類物質(zhì)常以果膠、原果膠的形態(tài)存在于植物細(xì)胞中,是構(gòu)成植物細(xì)胞壁的成分之一[6]。有研究表明,柚子皮中含有豐富的果膠,含量可達(dá)干物質(zhì)的30%左右[7]。我國柚子產(chǎn)量高,資源豐富[8],但目前柚子主要是用來鮮食,果皮大多被丟棄,而柚子皮占整個(gè)果實(shí)重量的30%～50%[9-10],被當(dāng)作廢棄物棄之會造成資源的浪費(fèi),故將柚子皮作為提取果膠的原材料,可大大的提高柚子附加值。

常用的果膠提取方法有酸提取法、超聲波提取法、微波提取法和酶提取法等[11-13]。酸提取法操作簡單,提取的果膠品質(zhì)好[14-15]。超聲波提取法可利用其產(chǎn)生的空化作用有效地破壞組織的細(xì)胞壁,并且能加快物質(zhì)的擴(kuò)散速度,從而利于果膠的快速溶出,以提高果膠得率[16]。酶解提取法是利用具有專一性和高效性的酶來分解破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞間質(zhì)等組織結(jié)構(gòu),從而提高果膠提取率[17]。酶法協(xié)同超聲波輔助酸提取法能有效結(jié)合酶解提取法、超聲波提取法和酸提取法三者的優(yōu)點(diǎn),能協(xié)同有效地提高果膠的提取率,用時(shí)短,應(yīng)用性強(qiáng)[18]。目前以酶法協(xié)同超聲波輔助酸法提取柚子皮中的果膠尚未見報(bào)道。

本研究以江西廣豐成熟期的馬家柚為原料,采用酶法協(xié)同超聲波輔助酸法提取柚子皮中的果膠,在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,運(yùn)用Plackett-Burnman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出對果膠得率有顯著影響的要素因子,進(jìn)一步采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化了柚子皮中果膠的提取工藝,可為柚子皮的深加工提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柚子 產(chǎn)自江西廣豐成熟期的馬家柚;纖維素酶(2×104U/g) 北京索萊寶科技有限公司;無水乙醇、濃鹽酸(均為分析純) 西隴化工股份有限公司。

HH-4恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ-400KDE超聲波清洗機(jī) 昆山市超聲儀器有限公司;ML204電子天平 上海精科天美有限公司;GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 無錫萊蒲儀器設(shè)備有限公司;PHS-3C pH計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 柚子皮的預(yù)處理 將新鮮柚皮切成碎塊,用熱水漂洗數(shù)次至無色,再置于60 ℃下干燥24 h,粉碎后過60目篩,將制備好的柚子粉末放入干燥器中密封備用。

1.2.2 柚子皮中果膠提取流程 稱取適量柚子皮粉末于500 mL錐形瓶中,以一定的料液比加入蒸餾水,根據(jù)柚子皮的質(zhì)量加入一定量的纖維素酶進(jìn)行水浴酶解一定時(shí)間,酶解完后用鹽酸調(diào)節(jié)提取液至一定pH,然后置于超聲波清洗機(jī)中在一定的功率計(jì)一定的提取溫度下超聲一定的時(shí)間提取果膠,提取完成后4000 r/min離心20 min,取上清液。再將1.5倍體積的無水乙醇緩慢加入上清液中,并不斷攪拌,靜置一段時(shí)間后8500 r/min離心10 min,收集沉淀,置于55 ℃烘箱中干燥至恒重得到果膠。

1.2.3 柚子皮中果膠提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 酶用量的確定 按照 1.2.2的方法,固定料液比為1∶20 g/mL,酶解時(shí)間為70 min,提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為30 min,研究酶用量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.2 酶解時(shí)間的確定 選擇最佳酶用量,固定料液比為1∶20 g/mL,提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為30 min,研究酶解時(shí)間(30、50、70、90、110 min)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.3 料液比的確定 選擇最佳酶用量、酶解時(shí)間,固定提取液pH為2.0,超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為30 min,研究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35 g/mL)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.4 提取液pH的確定 選擇最佳酶用量、酶解時(shí)間及料液比,固定超聲功率為250 W,提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為30 min,研究提取液pH(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.5 超聲功率的確定 選擇最佳酶用量、酶解時(shí)間、料液比和提取液pH,固定提取溫度為80 ℃,提取時(shí)間為30 min,研究超聲功率(150、200、250、300、350 W)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.6 提取溫度的確定 選擇最佳酶用量、酶解時(shí)間、料液比、提取液pH和超聲功率,固定提取時(shí)間為30 min,研究提取溫度(70、75、80、85、90 ℃)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.7 提取時(shí)間的確定 在上述最佳酶用量、酶解時(shí)間、料液比、提取液pH、超聲功率和提取溫度基礎(chǔ)上,研究提取時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)對柚子皮中果膠得率的影響。

1.2.3.8 Plackett-Burman試驗(yàn) 以果膠得率為響應(yīng)值,單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ),選取酶用量、酶解時(shí)間、料液比、提取液pH、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間共7個(gè)因素的水平值,選用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定顯著性影響因素,為進(jìn)一步Box-Behnken試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman

1.2.3.9 響應(yīng)面試驗(yàn) 在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上,以酶用量、超聲功率、提取溫度和提取時(shí)間為自變量,以柚子皮中果膠得率為響應(yīng)值,設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn),確定最佳果膠提取工藝。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 Design of Box-Behnken test

1.2.4 果膠得率的測定 果膠的得率采用重量法[19]。按照下列公式計(jì)算:

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次,結(jié)果取平均值,運(yùn)用Excel軟件繪制趨勢曲線圖。采用JMP Trial 14軟件進(jìn)行Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理,用Design-Expert 7.0軟件進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 果膠提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶用量的確定 由圖1可知,當(dāng)纖維素酶用量低于2.0%時(shí),柚子皮中果膠得率隨著酶用量的增加而增加,這可能是由于纖維素酶分解破壞了柚子皮細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),使得柚子皮中的果膠更易溶出,從而提高了果膠得率[16,20]。當(dāng)酶用量為2.0%時(shí),果膠得率達(dá)最大,為21.67%。繼續(xù)增大酶用量,果膠得率基本無變化,可能是由于反應(yīng)底物已全部被結(jié)合[21],導(dǎo)致果膠得率不再增加。因此選擇酶用量為2.0%。

圖1 酶用量對果膠得率的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on the yield of pectin

2.1.2 酶解時(shí)間的確定 由圖2可知,隨著酶解時(shí)間延長,柚子皮中果膠得率呈現(xiàn)先增加后緩慢減少的趨勢,當(dāng)酶解時(shí)間為70 min時(shí),果膠得率達(dá)最大值,可能是酶解時(shí)間達(dá)到70 min后,酶解基本完全,繼續(xù)延長酶解時(shí)間,會造成部分果膠水解,使得果膠得率降低。因此選擇酶解時(shí)間為70 min。

圖2 酶解時(shí)間對果膠得率的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of pectin

2.1.3 料液比的確定 由圖3可知,柚子皮中果膠得率隨著料液比的增大而增加,當(dāng)料液比為1∶25 g/mL時(shí),果膠得率達(dá)最大值。繼續(xù)增大料液比,果膠得率反而下降,可能是提取液比例過大,溶液中的果膠濃度太低,不利于果膠的溶出。因此選擇料液比為1∶25 g/mL。

圖3 料液比對果膠得率的影響Fig.3 Effect of material liquid ratio on the yield of pectin

2.1.4 提取液pH的確定 由圖4可知,提取液pH在1.0～3.0范圍內(nèi),柚子皮中果膠得率隨著pH的增大,呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢。當(dāng)pH為2.0時(shí),果膠得率達(dá)最大值?？赡苁怯捎趐H低于2.0時(shí),酸性太強(qiáng),導(dǎo)致果膠水解過度;pH高于2.0時(shí),因?yàn)樘崛∫核嵝詼p弱,使得原果膠水解成果膠的程度隨著提取液pH的升高而降低[22],從而導(dǎo)致果膠得率降低。因此選擇提取液pH為2.0。

圖4 pH對果膠得率的影響Fig.4 Effects of pH on the yield of pectin

2.1.5 超聲功率的確定 由圖5可知,當(dāng)超聲功率在150～300 W范圍內(nèi),柚子皮中果膠得率隨著超聲功率的增大而增加,超聲功率為300 W時(shí),果膠得率達(dá)最大值,繼續(xù)增大超聲功率,果膠得率顯著下降,可能是因?yàn)楣β蔬^高,超聲波的空化作用過強(qiáng),導(dǎo)致果膠水解過度,裂解成了多糖分子[23],從而使果膠得率下降。因此選擇超聲功率為300 W。

圖5 超聲功率對果膠得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic power on the yield of pectin

2.1.6 提取溫度的確定 由圖6可知,柚子皮中果膠的得率隨超聲提取溫度的升高呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)酶解溫度為80 ℃時(shí),果膠得率達(dá)最大值,提取溫度超過80 ℃后,會使果膠發(fā)生水解,導(dǎo)致得率降低。因此選擇提取溫度為80 ℃。

圖6 提取溫度對果膠得率的影響Fig.6 Effect of extraction temperature on the yield of pectin

2.1.7 提取時(shí)間的確定 由圖7可知,提取時(shí)間對柚子皮中果膠得率的影響較大,隨著提取時(shí)間的延長,果膠得率呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,當(dāng)提取時(shí)間為40 min時(shí),果膠得率達(dá)最大值,為25.71%。提取時(shí)間低于40 min時(shí),柚子皮中的原果膠未完全水解,使得果膠得率較低,但提取時(shí)間過長時(shí),溶液中的果膠在高溫酸性條件下會被降解[15],導(dǎo)致果膠得率下降。因此選擇提取時(shí)間為40 min。

表5 偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Table 5 Partial regression coefficients and their significance test

圖7 提取時(shí)間對果膠得率的影響Fig.7 Effect of extraction time on the yield of pectin

2.2 果膠提取Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值見表3,方差分析結(jié)果見表4,偏回歸系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)見表5。

表3 Plackett-Burman設(shè)計(jì)的各因素水平及響應(yīng)值Table 3 Experimental design and response results of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman 設(shè)計(jì)方差分析表Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman design

用JMP軟件對表3中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和顯著性檢驗(yàn)。由表4可知,該模型顯著(P<0.05)。由表5可知,因素X1(酶用量)、X5(超聲功率)、X6(提取溫度)和X7(提取時(shí)間)對柚子皮中果膠得率影響顯著(P<0.05),所以選擇X1、X5、X6、X7共4個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn);因素X2(酶解時(shí)間)、X3(料液比)和X4(提取液pH)對柚子皮中果膠得率影響不顯著,故在后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)中因素X2、X3和X4的條件固定為:酶解時(shí)間70 min、料液比1∶25 g/mL、提取液pH2.0。

2.3 果膠提取響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表6,用Design-Expert 7.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù),經(jīng)非線性回歸的二次多項(xiàng)式擬合,得到回歸模型為:Y=26.28+0.22A+0.23B-0.0075C+0.037D-0.27A2-0.27B2-0.12C2-0.14D2+0.050AB+0.067AC-0.040AD-0.0075BC+0.037BD+0.023CD,對回歸模型進(jìn)行方差分析,結(jié)果見表7。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Experimental design and results for response surface

表7 回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

圖8 酶用量和提取溫度交互作用的響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface of interaction of enzyme dosage and extraction temperature

由圖8可知,酶用量和提取溫度兩因素的交互作用對果膠得率的影響較大,得率隨著酶用量的增加和提取溫度的升高,均出現(xiàn)先增大后減小的趨勢,響應(yīng)面為凸型曲面,表明果膠得率存在極大值。

2.3.2 最優(yōu)工藝條件及驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)模型預(yù)測得到的最佳柚子皮中果膠提取工藝條件為:酶用量1.71%、超聲功率262.79 W、提取溫度83.07 ℃,提取時(shí)間49.86 min,在此最佳條件下,果膠得率理論上可達(dá)27.89%?？紤]實(shí)驗(yàn)的可操作性,修正最佳的工藝條件為:酶用量1.7%、超聲功率260 W、提取溫度83 ℃,提取時(shí)間50 min,在此條件下得出實(shí)際測得的果膠得率為27.01%±0.91%,與預(yù)測值的相對誤差為0.88%,說明該模型擬合程度良好。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化酶法協(xié)同超聲波輔助酸法提取柚子皮中果膠的工藝,得到最佳工藝條件為:酶用量1.7%、酶解時(shí)間70 min、料液比1∶25 g/mL、提取液pH2.0、超聲功率260 W、提取溫度83 ℃,提取時(shí)間50 min,在此條件下從柚子皮中提取果膠的得率為27.01%±0.91%。該方法結(jié)合了酶解提取法、超聲波提取法和酸提取法三者的優(yōu)點(diǎn),有效地提高了果膠得率,從而提高了柚子皮的附加值。