韓 威,沈華偉,殷建玫,朱云芬,沈海玉,李國輝,薛 倩,張會永,蘇一軍,竇新紅,王克華,鄒劍敏

(1.江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125;2.福建省畜牧總站，福建 福州 350003)

金湖烏鳳雞原產(chǎn)于福建省泰寧縣，2009年通過國家畜禽遺傳資源委員會鑒定.金湖烏鳳雞飼養(yǎng)歷史悠久，在長期的選擇和進(jìn)化過程中形成了烏皮、烏骨、烏肉、鳳頭、毛腳等典型特征，是我國家禽庫中具有特殊經(jīng)濟(jì)價值的遺傳資源.

開展雞種資源遺傳進(jìn)化研究，可以為品種資源的保護(hù)及開發(fā)利用提供基礎(chǔ)信息.目前，研究者已利用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記及線粒體DNA序列變異分析了金湖烏鳳雞的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)[1]，多個與烏骨雞黑色素沉積相關(guān)的功能基因(MC1R、EDN3等)也被鑒定[2-4].然而，這些DNA標(biāo)記數(shù)量較少，其所代表的基因組遺傳變異信息量非常有限，針對除黑色素沉積之外的金湖烏鳳雞其它種質(zhì)特性評價及功能基因發(fā)掘研究仍較少.

新一代測序技術(shù)實現(xiàn)了DNA分子標(biāo)記高通量檢測[5]，為從基因組水平上揭示雞遺傳進(jìn)化提供了高效準(zhǔn)確的方法.其中，全基因組重測序費(fèi)用較高，600 K雞芯片仍基于商業(yè)化蛋雞和肉雞及非商業(yè)的遠(yuǎn)交群基因組重測序數(shù)據(jù)開發(fā).簡化基因組測序由于能鑒定出合適數(shù)量、廣泛覆蓋基因組范圍的變異位點(diǎn)，已被用于不同物種群體的遺傳進(jìn)化研究[6-8].基于此，本研究利用簡化基因組RAD-seq測序(restriction-site associated DNA sequencing,RAD-seq)鑒定金湖烏鳳雞基因組SNP標(biāo)記，揭示金湖烏鳳雞的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，鑒定受選擇基因，為金湖烏鳳雞種質(zhì)特性評價、品種資源保護(hù)及開發(fā)利用提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

金湖烏鳳雞及對照組18個地方雞品種為狼山雞、安義瓦灰雞、固始雞、仙居雞、白耳黃雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、河南斗雞、文昌雞、大圍山微型雞、藏雞、茶花雞、瓢雞、惠陽胡須雞、大骨雞、蕭山雞、鹿苑雞、邊雞、北京油雞、2個引入雞品種隱性白羽肉雞、安卡紅雞來自國家級地方雞種基因庫(江蘇)保種群.每個品種按照家系選擇30個個體(10公、20母)，個體間無親緣關(guān)系.翅靜脈采血1.0 mL～1.5 mL，檸檬酸鈉抗凝，-20 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 方法

1.2.1 RAD-seq 簡化基因組測序 常規(guī)酚—氯仿法提取基因組DNA，構(gòu)建pair-end文庫(300～500 bp)進(jìn)行EcoRI(G^AATTC)和NlaIII(Hin1IICATG^)雙酶切RAD-seq簡化基因組測序.

1.2.2 SNP質(zhì)控 SNP的鑒定采用GATK和samtools程序.質(zhì)控條件：Q20>95%，ddRAD depth>60%，在所有樣品中的SNP Call rate>70%，在單個雞種中的SNP Call rate>90%，MAF>0.05.

1.2.3 統(tǒng)計分析 觀察雜合度(Ho)、近交系數(shù)(Fis)和群體分化指數(shù)(Fst)計算采用PopGen軟件[9]，群體聚類分析應(yīng)用MEGA軟件UPGMA聚類法[10].連鎖不平衡(LD)分析和選擇信號檢測采用PLINK軟件[11]，采用θπ比率和Fst分化系數(shù)相結(jié)合方法，以100 kb為窗口、10 kb為step計算滑動的θπ和Fst值分布.統(tǒng)計分析基于常染色體(Chr1～33)SNP標(biāo)記.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組SNP鑒定

經(jīng)過兩步數(shù)據(jù)質(zhì)控，在金湖烏鳳雞中鑒定出SNP 325 531個.總體上，SNP數(shù)量與染色體長度呈正相關(guān)，大染色體SNP數(shù)量較多，其中1～9號及Z染色體SNP數(shù)量均超過9 000個，小染色體SNP數(shù)量較少(表1).

表1 SNP在不同染色體上的分布Table 1 SNP distributions on different chromosomes

2.2 群體遺傳多樣性

群體遺傳多樣性統(tǒng)計量結(jié)果表明，金湖烏鳳雞的觀察雜合度Ho為0.213 6，核苷酸多樣度Pi為0.240 4，近交系數(shù)Fis為0.111 6(表2).與其它地方雞種相比，金湖烏鳳雞的遺傳多樣性較為豐富.

2.3 群體遺傳結(jié)構(gòu)

金湖烏鳳雞與河南斗雞(0.214 3)、北京油雞(0.184 5)和固始雞(0.180 2)之間的遺傳分化系數(shù)Fst最高，與瓢雞(0.107 9)、文昌雞(0.120 2)和惠陽胡須雞(0.124 1)之間的遺傳分化系數(shù)Fst最低，相對應(yīng)的基因流Nm也最高，分別為2.067 7、1.830 2和1.764 7(表3).以隱性白羽肉雞、安卡紅雞做外群構(gòu)建的UPGMA聚類結(jié)果表明，金湖烏鳳雞形成了一個相對獨(dú)立的分支(圖1).

表2 種群的觀察雜合度、核苷酸多樣度和近交系數(shù)Table 2 Values of Ho,Pi and Fis for tested breeds

表3 金湖烏鳳雞與其它品種間遺傳分化系數(shù)和基因流Table 3 Fst and Nm between Jinhu Wufeng chicken and other breeds

JH金湖烏鳳雞、LS狼山雞、WH安義瓦灰雞、GS固始雞、XJ仙居雞、BE白耳黃雞、DX東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、DJ河南斗雞、WC文昌雞、WX大圍山微型雞、ZZ藏雞、CH茶花雞、PJ瓢雞、HX惠陽胡須雞、DG大骨雞、XS蕭山雞、LY鹿苑雞、BJ邊雞、BY北京油雞、RW隱性白羽肉雞、AK安卡紅雞.圖1 金湖烏鳳雞及其它雞種的UPGMA聚類Fig.1 UPGMA phylogenetic tree of Jinhu Wufeng chicken and other breeds

2.4 選擇信號

結(jié)合核苷酸多樣度θπ比率和遺傳分化系數(shù)Fst的選擇信號分析發(fā)現(xiàn)23個染色體區(qū)域受到選擇，104個受選擇基因.功能分析結(jié)果表明，整體上，受選擇基因主要富集在代謝過程、發(fā)育過程、細(xì)胞信號傳導(dǎo)和刺激響應(yīng)等生物學(xué)通路(圖2).其中，與黑色素沉積(TFAP2C、GDNF、MC1R、EDN3、TBX1、GLI3、GNAQ、MEF2C)、輻射響應(yīng)(ERCC8、PRKAA1)、就巢行為(PRLR、CYP24A1、VIPR-1)、皮膚發(fā)育(THBS4、THAP1、DHCR24)及抗病力(PDE4D、NFATC2、TNFAIP8)相關(guān)的基因顯示出強(qiáng)烈選擇信號.

圖2 受選擇區(qū)域基因功能注釋Fig.2 Functional annotation and classification of the selected genes

3 討論

3.1 金湖烏鳳雞遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)

文中利用RAD-seq測定了19個地方雞種的基因組序列，通過質(zhì)控在金湖烏鳳雞中鑒定出325 531個SNP標(biāo)記，這為構(gòu)建品種分子標(biāo)簽和在基因組水平上開展遺傳進(jìn)化分析提供了基礎(chǔ).

在19個地方雞種中，金湖烏鳳雞的觀察雜合度Ho為0.213 6，核苷酸多樣度Pi為0.240 4，遺傳多樣性較為豐富，這與已報道的基于微衛(wèi)星DNA及線粒體DNA的金湖烏鳳雞遺傳變異分析結(jié)果基本一致[1].金湖烏鳳雞與其它地方雞種的平均遺傳分化系數(shù)Fst為0.155 6，平均基因流Nm為1.398 2，在進(jìn)化樹上形成相對獨(dú)立的分支.金湖烏鳳雞原產(chǎn)地交通閉塞形成自然隔離，很少有外來雞種進(jìn)入，與其它地方雞品種間的基因交流相對較少；已報到的針對我國地方烏骨雞品種遺傳多樣性研究，也發(fā)現(xiàn)金湖烏鳳雞除與相同產(chǎn)區(qū)的絲絨烏骨雞間遺傳距離較近外，與其它烏骨雞品種間遺傳距離均較遠(yuǎn)[12].

金湖烏鳳雞群體的近交系數(shù)Fis(0.111 6)相對較高，提示在保種過程中要嚴(yán)格控制近交水平的過快增加.

3.2 金湖烏鳳雞選擇信號

自然選擇和人工選擇作用會在動物基因組上留下選擇信號，開展選擇信號分析有助于理解遺傳變異對表型的塑造.研究者通過檢測地方豬、羊等品種的基因組選擇信號，發(fā)掘出大量種質(zhì)特性基因[13-16].針對雞而言，Rubin et al[17]通過重測序在家雞中鑒定了與代謝調(diào)節(jié)和生殖光周期調(diào)控相關(guān)的促甲狀腺激素受體基因TSHR，在肉雞中檢測到的幾個選擇性片段上，發(fā)現(xiàn)與生長、食欲和代謝調(diào)控相關(guān)的基因重疊在一起.Elferink et al[18]利用芯片檢測了商業(yè)化品系雞、荷蘭和中國地方雞種的基因組變異，發(fā)現(xiàn)396個染色體區(qū)域受到選擇作用，其中26個區(qū)域顯示出強(qiáng)烈的選擇信號.Wang et al[19-20]研究表明，藏雞群體中受到選擇作用的基因在鈣離子信號通路中顯著富集，大量視覺相關(guān)基因在家雞馴化過程中受到正選擇作用，導(dǎo)致視覺退化.

研究中，選擇信號分析結(jié)果表明，金湖烏鳳雞中有23個染色體區(qū)域受到選擇作用，104個受選擇基因顯著富集于不同的生物學(xué)通路.黑色素沉積是烏骨雞品種進(jìn)化過程中形成的最顯著特征.神經(jīng)嵴細(xì)胞是一種多能細(xì)胞，分化的成黑素細(xì)胞沿背側(cè)途徑遷移，定位至皮膚、冠及組織，并形成成熟的黑色素細(xì)胞[2,21].選擇信號分析發(fā)現(xiàn)金湖烏鳳雞基因組中，多個與神經(jīng)嵴細(xì)胞分化遷移、黑色素細(xì)胞發(fā)育增殖及黑色素合成相關(guān)的基因受到了選擇，包括TFAP2C、GDNF、MC1R、EDN3、TBX1、GLI3、GNAQ、MEF2C等.研究證實，TFAP2家族(包括TFAP2A、TFAP2B和TFAP2C)是神經(jīng)嵴誘導(dǎo)所必需的[22,23]，GDNF[24,25]、TBX1[26,27]是神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育和遷移的調(diào)節(jié)因子，MEF2C在神經(jīng)嵴表達(dá)并調(diào)節(jié)黑色素細(xì)胞發(fā)育[28,29]，GNAQ基因變異與黑素瘤生成有關(guān)[30,31].MC1R屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族成員，在黑色素細(xì)胞與黑色素合成激素的互作中起著重要的信號傳遞作用，是影響皮毛色素沉積的重要基因；楊永升等[32]研究發(fā)現(xiàn)MC1R基因突變與雞膚色、肉色和脛色顯著相關(guān).EDN3在神經(jīng)嵴源黑色素細(xì)胞的發(fā)育過程中起著重要的信號傳遞作用，Dharmayanthi et al[3]、Dorshorst et al[21]和Shinomiva et al[33]研究表明，EDN3是絲羽烏骨雞黑色素沉積調(diào)控基因，其多拷貝重組的作用機(jī)制在來源于亞洲和歐洲色素過度沉積雞品種中表現(xiàn)一致.黑色素在功能上具有抗紫外輻射的光保護(hù)性，與輻射響應(yīng)相關(guān)的基因(ERCC8、PRKAA1)也受到了選擇.這些貫穿于黑色素整個形成過程基因的選擇作用，形成了金湖烏鳳雞全身性色素過度沉積的特征.

與國外商業(yè)化蛋雞品種追求高產(chǎn)蛋不同，我國大多數(shù)地方雞品種(尤其是交通閉塞地區(qū)分布品種)長期以來主要以家庭自給自足飼養(yǎng)方式，人為選留就巢性強(qiáng)母雞個體用以孵化.金湖烏鳳雞就巢率高(近乎100%)，與就巢及母性行為相關(guān)的基因PRLR、CYP24A1、VIPR-1等受到了選擇.與皮膚發(fā)育、內(nèi)皮細(xì)胞分化增殖相關(guān)的基因THBS4、THAP1和DHCR24也受到了選擇，這些基因的作用可能使得金湖烏鳳雞形成了較其它地方雞種更厚的皮膚和粗大的毛孔.另外，T細(xì)胞信號通路、白細(xì)胞介素生成、嗜中性粒細(xì)胞趨化及免疫球蛋白生成等免疫基因(PDE4D、NFATC2、TNFAIP8等)也受到了選擇，表明金湖烏鳳雞具有較強(qiáng)的抗病力.

綜上所述，利用基因組SNP標(biāo)記能更準(zhǔn)確地揭示金湖烏鳳雞的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，選擇作用主要是體現(xiàn)在對金湖烏鳳雞黑色素沉積、皮膚發(fā)育、就巢行為及抗病特性等方面的塑造.