江絮萍，李杰萍，何拉曼，黃海燕

0 引 言

宮頸癌是女性發(fā)生頻率很高的惡性腫瘤，僅次于乳腺癌[1-3]。國際上通常把妊娠期、產(chǎn)褥期和產(chǎn)后6個月內(nèi)發(fā)生的宮頸癌稱為妊娠合并宮頸癌，也稱妊娠相關(guān)性宮頸癌[4]。目前，宮頸癌篩查和診斷的方法主要分為三步：首先是初篩，即進(jìn)行陰道分泌物或脫落細(xì)胞涂片；初篩陽性患者再進(jìn)行陰道鏡檢；鏡檢結(jié)果懷疑癌變患者則最后通過鏡下取活組織做病理切片確診[5-6]。對于妊娠期婦女而言，由于擔(dān)心宮頸檢查或取活組織產(chǎn)生的創(chuàng)傷引起流產(chǎn)，部分患者在產(chǎn)前檢查時不檢查宮頸或不進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查，從而導(dǎo)致漏診和誤診。此外，陰道流血容易被誤認(rèn)為與妊娠有關(guān)，從而忽略上述檢查[7]。因此，尋找一種新的既無創(chuàng)簡便，同時又準(zhǔn)確高效的妊娠合并宮頸癌診斷方法是十分有意義的。

唾液作為一種極易取得，且成分同身體健康狀況高度相關(guān)的體液，在近10余年中已經(jīng)成為很多腫瘤診斷技術(shù)研究中的診斷液[8-9]。唾液的成分復(fù)雜[10]，蛋白/肽段種類極其豐富[11]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移同異常的蛋白/肽段的磷酸化水平通常有很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性，而體內(nèi)蛋白/肽段的磷酸化水平變化會直接在唾液中表現(xiàn)出來[12-14]。因此，可以通過直接分析唾液中內(nèi)源性磷酸化肽段(不用酶解而直接存在的磷酸化肽段)來進(jìn)行疾病的早期診斷。目前，唾液中內(nèi)源性磷酸化肽段的表達(dá)種類與表達(dá)量用于妊娠合并宮頸癌診斷的相關(guān)研究還不完善。為此，本研究采集Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者和健康孕婦的唾液，對其中的內(nèi)源性磷酸化肽段進(jìn)行富集后，再利用基質(zhì)輔助激光解析(Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)質(zhì)譜進(jìn)行定性定量檢測。根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析其中的差異，初步探究唾液內(nèi)源性磷酸化肽段在妊娠合并宮頸癌中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2016年至2018年期間在武警福建省總隊醫(yī)院婦產(chǎn)科生產(chǎn)的健康孕婦(38例)，以及同期在武警福建省總隊醫(yī)院(10例)、上海第一婦嬰(18例)和福建省人民醫(yī)院(8例)接受妊娠合并宮頸癌檢查的患者。妊娠合并宮頸癌患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：①按照2009年FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)劃分，經(jīng)病理檢查證實為Ⅰ～Ⅲ期宮頸癌；②具有完整的診療記錄；③采樣前未接受腫瘤切除手術(shù)；④采樣前未接受放療或化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：除宮頸癌外，還患有其他重大疾病的患者。健康孕婦的納入標(biāo)準(zhǔn)為未診斷出患有重大疾病。共有74例受試者納入本研究，年齡(33.9±14.3)歲。其中，健康孕婦38例(健康孕婦組)，年齡(33.1±13.5)歲。妊娠合并宮頸癌患者36例，年齡(36.1±12.1)歲，按臨床分期分為：Ⅰ期組12例，年齡(32.4±8.4)歲；Ⅱ期組13例，年齡(34.1±14.1)歲；Ⅲ期組11例，年齡(35.2±10.7)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：第12號)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2唾液采集方法每位健康孕婦在妊娠中期(20～28周)內(nèi)采集唾液樣品2份，每位患者在確診為妊娠合并宮頸癌后3 d內(nèi)采集唾液樣品2份。所有受試者均在上午10-11點之間采集唾液。采集前2 h內(nèi)禁止飲食，采集前10 min清洗口腔。使用德國薩斯特公司(Sarstedt)的唾液采集管，并按照其推薦步驟采集唾液。每份獲得的唾液樣品各取200 μL置于離心管中，冷凍離心干燥后存于-80 ℃冰箱待用。

1.3唾液內(nèi)源性磷酸化肽段富集方法使用美國賽默飛世爾公司(ThermoFisher)的磷酸化肽段富集試劑盒(High-Select TiO2Phosphopeptide Enrichment Kit)，并按照試劑盒的推薦步驟依次操作，完成對上述干燥后的唾液樣品的富集。最終得到的含磷酸化肽段的洗脫液為質(zhì)譜測試樣品。

1.4質(zhì)譜測試方法使用美國愛博才思公司(AB SCIEX)的5800 MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析樣品。具體步驟為取1 μL洗脫液點在MALDI靶板上，干燥后再點上0.7 μL DHB(25 mg/mL)基質(zhì)，再次干燥后進(jìn)行質(zhì)譜分析。質(zhì)譜檢測質(zhì)荷比(m/z)范圍1000～3000。每份洗脫液均按上述方法在靶板上點2個樣品點，每個點進(jìn)行2次質(zhì)譜分析。除正常的質(zhì)譜測試外，在健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者的洗脫液樣品中各隨機(jī)選取一份，分別進(jìn)行7次重復(fù)性實驗(內(nèi)源性磷酸化肽段+質(zhì)譜分析)。

1.5質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析定性分析方法：首先選出一張譜圖中所有信噪比(S/N)≥10的一級質(zhì)譜峰，依次進(jìn)行串級質(zhì)譜分析；如主要碎片離子同母離子相差98 Da(丟失H3PO4)，則證明母離子中含有磷酸根，母離子對應(yīng)肽段為磷酸化肽段；后續(xù)的譜圖中，如發(fā)現(xiàn)同之前鑒定到的磷酸化肽段質(zhì)荷比數(shù)相差±0.1 Da以內(nèi)的一級質(zhì)譜峰，即認(rèn)為是同一磷酸化肽段，不用再次進(jìn)行串級質(zhì)譜分析。

定量分析方法：直接使用質(zhì)譜信號強(qiáng)度代表譜圖中的磷酸化肽段豐度；未鑒定到的磷酸化肽段豐度記為0；每例受試者的唾液磷酸化肽段豐度使用全部8張譜圖(2份唾液樣品×每份樣品2個樣品點×每個樣品點質(zhì)譜分析2次)的平均值。

各組受試者中各條唾液內(nèi)源性磷酸化肽段的相對豐度的計算方法為：首先計算各條磷酸化肽段在各組受試者唾液樣品中的平均豐度；然后將所有磷酸化肽段在各組中的平均豐度分別在各組之間進(jìn)行歸一化(令最大值為100)，得到最終表內(nèi)數(shù)據(jù)。相對豐度為0即為在該組中未鑒定到該條肽段。

健康-妊娠合并宮頸癌P值的計算方法為：對于任意一條唾液磷酸化肽段，將38例健康孕婦組中每例受試者的對應(yīng)唾液磷酸化肽段豐度數(shù)據(jù)，同36例Ⅰ～Ⅲ期宮頸癌患者組中每例受試者的對應(yīng)唾液磷酸化肽段豐度數(shù)據(jù)相比較，使用t檢驗的方法計算P值。

按照每條磷酸化肽段的相對豐度同該條磷酸化肽段在各組受試者唾液樣品中的平均豐度的哪個值最接近就判斷為對應(yīng)的疾病狀態(tài)，再同實際臨床診斷結(jié)果相比對，統(tǒng)計得到各條磷酸化肽段在不同組癌癥患者中的診斷準(zhǔn)確率。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。計量資料采用平均數(shù)表示，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)(百分率)表示，采用卡方檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 唾液內(nèi)源性磷酸化肽段檢測方法的驗證不經(jīng)過富集，直接進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析的唾液樣品的質(zhì)譜譜圖中無磷酸化肽段質(zhì)譜信號峰。經(jīng)過富集后，再進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析的唾液樣品的質(zhì)譜譜圖中磷酸化肽段質(zhì)譜峰清晰可見。典型的受試者的唾液樣品在進(jìn)行磷酸化肽段富集前后的MALDI質(zhì)譜圖見圖1。在所有24條信噪比大于10的質(zhì)譜峰中有16條磷酸化肽段，比例高達(dá)67%(16/24)。重復(fù)性實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4組唾液樣品在7次重復(fù)性實驗中鑒定磷酸化肽段種類的重合度均大于90%，相同質(zhì)譜峰的信號強(qiáng)度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于10%。

a：富集前(無磷酸化肽段信號)；b：富集后(磷酸化肽段，使用星號標(biāo)記)

圖1 一位受試者的唾液樣品在進(jìn)行磷酸化肽段富集前后的質(zhì)譜圖

2.2唾液內(nèi)源性磷酸化肽段的檢測結(jié)果在全部74例受試者的唾液樣品中，共鑒定到25條內(nèi)源性磷酸化肽段。其中，健康孕婦22條(88%，22/25)，Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者20條(80%，20/25)，Ⅱ期患者21條(84%，21/25)，Ⅲ期患者19條(76%，19/25)。4組受試者的唾液樣品中鑒定到的內(nèi)源性磷酸化肽段及其相對豐度見表1。15條(60%，15/25)唾液磷酸化肽段的豐度在健康孕婦和妊娠合并宮頸癌患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者之間共同存在的內(nèi)源性磷酸化肽段有13條，占總共鑒定到的52%(13/25)。僅存在于健康孕婦唾液中有3條肽段(12%，3/25)，質(zhì)荷比為1270.3、1589.4和2004.7。僅存在于妊娠合并宮頸癌患者唾液中有3條肽段(12%，3/25)，質(zhì)荷比為1076.4、2119.7和2722.8。從健康孕婦唾液同妊娠合并宮頸癌患唾液中肽段含量的差異來看，健康孕婦唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液最高的質(zhì)譜信號強(qiáng)度之比大于2的磷酸化肽段有3條(12%，3/25)，質(zhì)荷比為1270.3、1589.4、2004.7。健康孕婦唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液最低的質(zhì)譜信號強(qiáng)度(不含0)之比小于0.5的有7條(28%，7/25)，質(zhì)荷比為1076.4、1230.3、1461.4、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。從肽段含量的變化趨勢來看，從健康孕婦到Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者唾液中含量依次增加的磷酸化肽段有2條(8%，2/25)，質(zhì)荷比為1461.4和2722.8；依次下降的磷酸化肽段有1條(4%，1/25)，質(zhì)荷比為1784.6。綜上，共有11條唾液內(nèi)源性磷酸肽段(44%，11/25)是潛在的妊娠合并宮頸癌診斷標(biāo)志物。它們的質(zhì)荷比分別為1076.4、1230.3、1270.3、1461.4、1589.4、1784.6、2004.7、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。僅存在于癌中的3條磷酸化肽段(質(zhì)荷比為1076.4、2119.7和2722.8)能夠最方便的區(qū)分出健康孕婦與妊娠合并宮頸癌患者。統(tǒng)計這3條磷酸化肽段在不同組癌癥患者中的診斷準(zhǔn)確率。結(jié)果為質(zhì)荷比為1076.4的診斷準(zhǔn)確率分別為Ⅰ期45%、Ⅱ期43%、Ⅲ期52%；質(zhì)荷比為2119.7的診斷準(zhǔn)確率分別為Ⅰ期66%、Ⅱ期56%、Ⅲ期51%；質(zhì)荷比為2722.8的診斷準(zhǔn)確率分別為Ⅰ期44%、Ⅱ期40%、Ⅲ期48%。

表1 各組受試者中各條唾液內(nèi)源性磷酸化肽段(使用質(zhì)荷比表示)的相對豐度

質(zhì)荷比(m/z)健康孕婦組(n=38)Ⅰ期組(n=12)Ⅱ期組(n=13)Ⅲ期組(n=11)P值1000.247100073<0.011076.407633100<0.011114.33777100590.0421155.31004870340.0911230.319491000<0.011270.3100000<0.011311.49810083810.251386.45293100430.191426.49437901000.0921461.41969791000.0471481.599010067<0.011538.53110039890.0741589.4100000<0.011596.58313971000.0811637.64567100130.0611704.498851000<0.011752.67623100650.0871784.61009873200.0541899.637100260<0.012004.7100000<0.012119.703010072<0.012323.72310067720.0322541.815010069<0.012722.807981100<0.012837.88277151000.053

3 討 論

3.1 唾液內(nèi)源性磷酸化肽段檢測方法的合理性唾液成分復(fù)雜，且內(nèi)源性磷酸化肽段豐度極低[15]。直接用MALDI質(zhì)譜進(jìn)行分析所得到的譜圖雜亂，高豐度成分將磷酸化肽段信號完全抑制，導(dǎo)致無磷酸化肽段信號。因此，需要先使用富集材料(如TiO2)抓取唾液中的內(nèi)源性磷酸化肽段，然后通過洗滌富集材料將絕大部分非目標(biāo)物質(zhì)去除，最終得到雜質(zhì)較少、濃度較高的磷酸化肽段洗脫液后再進(jìn)行MALDI質(zhì)譜分析。本研究中使用的磷酸化肽段富集試劑盒可以保證富集方法的有效性。實驗結(jié)果顯示在富集后的唾液MALDI質(zhì)譜圖中，大部分信噪比大于10的質(zhì)譜峰為磷酸化肽段。與相關(guān)富集分析唾液中內(nèi)源性磷酸化肽段文獻(xiàn)相對比，本文中的富集效果(67%)同國內(nèi)外的研究水平相近[16-17]。使用商用唾液采集管和磷酸化肽段富集試劑盒還可以保證整個方法的重復(fù)性。重復(fù)性實驗結(jié)果顯示，在各組受試者的唾液樣品中，本研究采用的方法在定性和定量方面均具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。這為使用唾液內(nèi)源性磷酸化肽段作為指標(biāo)對妊娠合并宮頸癌患者進(jìn)行診斷打下了基礎(chǔ)。

3.2唾液內(nèi)源性磷酸化肽段的診斷價值唾液內(nèi)源性磷酸肽段在健康孕婦及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。通過這些差異，在本研究的結(jié)果部分共分析總結(jié)出11條可能成為妊娠合并宮頸癌診斷標(biāo)志物的唾液內(nèi)源性磷酸肽段，表明唾液內(nèi)源性磷酸化肽段對妊娠合并宮頸癌具有一定的診斷價值。對于診斷指標(biāo)而言，首要目的是區(qū)分健康與疾病狀態(tài)。在上述11條肽段中，3條僅存在于健康孕婦唾液中(m/z：1270.3、1589.4和2004.7)和3條僅存在于妊娠合并宮頸癌患者唾液中(m/z：1076.4、2119.7和2722.8)的內(nèi)源性磷酸化肽段能最清楚的區(qū)分健康孕婦和Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者。同時，根據(jù)僅存在于癌中的3條肽段的量的差異，還可以進(jìn)一步區(qū)分具體的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期。對于癌癥而言，早期癌癥患者有更高的幾率可以治愈，而晚期的癌癥患者則通常難以治愈[18]。因此癌癥的早期診斷具有更重要意義。值得注意的是，質(zhì)荷比為2119.7的唾液內(nèi)源性磷酸化肽段診斷Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宮頸癌患者的準(zhǔn)確率均超過了50%，且診斷Ⅰ期妊娠合并宮頸癌患者的準(zhǔn)確率達(dá)到了66%。說明該唾液內(nèi)源性磷酸化肽段可以較準(zhǔn)確的區(qū)分出Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期(特別是Ⅰ期)妊娠合并宮頸癌患者，具有診斷早期妊娠合并宮頸癌的能力。這一準(zhǔn)確率水平同現(xiàn)有文獻(xiàn)中報道的通過檢測血清miRNA[19-22]，或者聯(lián)合檢測組織中蛋白標(biāo)志物[23]，從而進(jìn)行宮頸癌早期診斷的方法相近。當(dāng)然，由于使用的樣品為唾液，因此本文的方法更加簡便，對患者無傷害。

綜上所述，唾液內(nèi)源性磷酸化肽段在妊娠合并宮頸癌中有很高的診斷價值。本研究共發(fā)現(xiàn)11條唾液內(nèi)源性磷酸肽段是潛在的妊娠合并宮頸癌診斷標(biāo)志物。其中，質(zhì)荷比為2119.7的磷酸化肽段還可以較準(zhǔn)確的區(qū)分具體的癌癥臨床階段。特別是利用該磷酸化肽段區(qū)分Ⅰ期妊娠合并宮頸癌的準(zhǔn)確率達(dá)到了66%，具有重要的研究意義和早期診斷價值。當(dāng)然，這些唾液內(nèi)源性磷酸化肽段診斷妊娠合并宮頸癌的可靠性還有待未來更多的臨床樣本進(jìn)行驗證。