劉春媛 廖峰 汝文文

摘要 [目的]研究阿膠多糖的分離提純工藝及其抑制酪氨酸酶活性。[方法]針對阿膠多糖提取中蛋白質(zhì)的干擾，通過對幾種脫蛋白方法（TCA法、Sevage法、蛋白酶法）的比較，優(yōu)選出阿膠多糖提取液的脫蛋白方法，并探討阿膠多糖對酪氨酸酶的抑制作用。[結(jié)果]TCA法、Sevage法及蛋白酶法的脫蛋白率分別為78.94%、87.73%和29.97%，多糖保留率分別為73.96%、32.14%和72.57%。所得阿膠多糖對酪氨酸酶有一定的抑制作用，當濃度為1 mg/mL時，抑制率為24.42%。[結(jié)論]TCA法脫蛋白率較高、多糖損失率較低，篩選方法可有效去除阿膠粗多糖中的蛋白，所得阿膠多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用。

關(guān)鍵詞 阿膠;多糖;脫蛋白方法;蛋白純化;酪氨酸酶

中圖分類號 R966 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0182-03

Abstract [Objective] The research aimed to study the separation and purification process of crude polysaccharide of donkeyhidegelatin and its inhibition of tyrosinase activity.[Method] Aiming at the interference of protein in the extraction of donkeyhidegelatin polysaccharides，the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized by comparing several deproteinization methods（TCA method，Sevage method and protease method），the deproteinization method of donkeyhidegelatin polysaccharide extract was optimized，and the inhibitory effect of donkeyhidegelatin polysaccharide on tyrosinase was discussed.[Result]The deproteinization rates of TCA，Sevage and protease were 78.94%，87.73% and 29.97%，respectively，and the polysaccharide retention rates were 73.96%，32.14% and 72.57%，respectively.The obtained gelatin polysaccharide had a certain inhibitory effect on tyrosinase.When the concentration was 1 mg/mL，the inhibition rate was 24.42%.[Conclusion]The TCA method has higher deproteinization rate and lower polysaccharide loss rate.The screening method can effectively remove the protein from the crude polysaccharide of donkeyhidegelatin，and the obtained donkeyhidegelatin polysaccharide has a good inhibitory effect on tyrosinase.

Key words Donkeyhidegelatin;Polysaccharide;Deproteinization methods;Protein purification;Tyrosinase

多糖作為構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于自然界動植物等有機體中[1]，其含有多羥基和羧基結(jié)構(gòu)，可與水分子形成氫鍵網(wǎng)絡而鎖住水分，從而具有保濕作用[2]。多糖能夠抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的生成，從而達到美白功效[3]。一些大分子多糖可激活并增強機體內(nèi)SOD等抗氧化物酶活性，達到抗氧化功效[4]。此外，多糖還具有皮膚組織修復作用、抗衰老作用等[5]，因其有較高的安全性，被廣泛應用于化妝品中。

阿膠作為補血補虛、滋補強壯的良藥，自《神農(nóng)本草經(jīng)》以來一直沿用至今，在我國已有3 000多年的歷史，無論是單方使用，還是用于復方配伍，都有著豐富的記載[6]。阿膠味甘、性平，歸肺、肝、腎經(jīng)，具有補血滋陰、潤燥、止血之功效，被歷代醫(yī)家尊稱為補血“圣藥”[7]。阿膠中的多糖雖然部分是外源性添加，且含量相對其他成分較低，但是其在加工過程中經(jīng)過高溫熬煮，可與蛋白質(zhì)等成分發(fā)生化學反應，產(chǎn)生不可預知的生物學修飾。近年來雖然對植物多糖的報道較多，但是阿膠多糖在化妝品領(lǐng)域的應用少之甚少，仍處于研究階段。筆者對阿膠多糖的分離提純工藝及其抑制酪氨酸酶活性進行研究，為后期將阿膠多糖分子開發(fā)為化妝品功效成分奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試材

阿膠（批號1707038），東阿阿膠集團提供;無水乙醇、三氯乙酸、濃硫酸、氯仿、正丁醇，國藥集團化學試劑有限公司;苯酚，Macklin;葡萄糖，Sigma;BCA蛋白濃度測定試劑盒，天根;L-酪氨酸、酪氨酸酶、熊果苷，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

VO400真空干燥箱，Memmert公司;MX-S渦旋振蕩器，SCILOGEX公司;MS-H280-Pro磁力攪拌器，SCILOGEX公司;MULTISKAN GO多功能酶標儀，Thermo公司;UV-1800紫外分光光度計，島津;ML303分析天平，梅特勒公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 多糖含量測定。

采用苯酚-硫酸法[8]測定多糖含量，在490 nm處測定吸光度，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出標準曲線的回歸方程：y=0002 3x+0.064 5（R2=0.999 24，n=3）。

1.3.2 蛋白質(zhì)含量測定。

采用BCA法[9]測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白作標準品，在595 nm處測定吸光度，標準蛋白質(zhì)濃度在0～500 μg/mL與吸光度有較好的線性關(guān)系，回歸方程為y=0.555 63x+0.066 40（R2=0.999 66，n=3）。

1.3.3 阿膠粗多糖成分提取。

取一定量的阿膠樣品，以料液比1∶10加入蒸餾水，80 ℃水浴浸提2 h，離心取上清液，加入無水乙醇進行醇沉，乙醇終濃度至90%，攪拌均勻，于4 ℃靜置過夜后，離心取沉淀，于真空干燥箱中進行干燥，稱重。取0.4 g粗多糖溶于40 mL蒸餾水，測定多糖含量。

1.3.4 不同脫蛋白方法。

1.3.4.1 TCA法。

取“1.3.3”提取的粗多糖溶解于蒸餾水中，離心取上清液，分別加入60%三氯乙酸溶液，至終濃度為5%、15%、30%，混勻后于4 ℃靜置過夜，離心棄去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.4.2 Sevage法。

取“1.3.3”中的粗多糖溶于蒸餾水中，離心取上清，粗多糖溶液和Sevage（氯仿∶正丁醇=4∶1）以4∶1比例混勻，劇烈振蕩20 min后，3 000 r/min離心10 min，取上清液，反復多次至兩相界無變性蛋白出現(xiàn)。

1.3.4.3 蛋白酶法。

取一定量粗多糖溶于蒸餾水中，離心取上清，分別加入不同酶活力單位的木瓜蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH為6.0，混勻后于60 ℃酶解2.5 h，反應結(jié)束后沸水浴10 min，冷卻至室溫，3 000 r/min離心10 min，離心棄去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.5 酪氨酸酶活性抑制試驗。

分別取1 mL不同質(zhì)量濃度的阿膠多糖溶液（以磷酸緩沖液為空白，對照品為熊果苷），與1.66 mmoL的L-酪氨酸混合，37 ℃下孵育5 min，加入酪氨酸酶（900 U）250 μL，37 ℃下孵育10 min，475 nm波長處測定吸光度，計算酪氨酸酶活性抑制率。

1.3.6 計算公式。

蛋白清除率=脫蛋白前A562-脫蛋白后A562脫蛋白前A562×100%（1）

多糖保留率=脫蛋白后多糖A490脫蛋白前多糖A490×100%（2）

綜合評分=0.5×（多糖保留率多糖保留率最大值+蛋白質(zhì)清除率蛋白質(zhì)清除率最大值）×100（3）

酪氨酸酶抑制率=（A-B）-（C-D）A-B×100%（4）

其中，A為未加樣品而加酪氨酸酶的混合液;B為未加樣品、酪氨酸酶的混合液;C為加樣品、酪氨酸酶的混合液;D為加樣品而未加酪氨酸酶的混合液。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿膠樣品多糖、蛋白質(zhì)測定

采用硫酸-苯酚法測得阿膠樣品中多糖含量為26 mg/g，BCA 法測得蛋白質(zhì)含量為435 mg/g;阿膠粗多糖樣品的多糖含量為35 mg/g，蛋白質(zhì)含量為324 mg/g。

2.2 不同脫蛋白方法比較

以蛋白清除率和多糖保留率為評價指標，采用TCA法、Sevage法和蛋白酶法對阿膠粗多糖溶液進行脫蛋白處理。

2.2.1 TCA法。

TCA作為蛋白質(zhì)變性劑使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，暴露出較多的疏水性基團，使之聚集沉淀。由圖1可知，隨著TCA終濃度的增加，蛋白質(zhì)清除率逐漸增大后達到基本平衡。TCA濃度為5%時，因其只能結(jié)合多糖中的一部分蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)清除率低，僅為27.94%;隨著TCA濃度的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增大，多糖保留率也隨之降低，這可能是低濃度TCA脫蛋白時，蛋白質(zhì)沉淀過程中會吸附或夾帶部分多糖而造成多糖損失[10];當高濃度TCA沉淀蛋白質(zhì)時，不僅使游離蛋白質(zhì)沉淀下來，而且會沉淀多糖溶液中的部分糖蛋白，并引起部分多糖的降解，導致多糖保留率降低[11]。亦或者是TCA對阿膠多糖結(jié)構(gòu)具有破壞作用，使多糖降解，結(jié)構(gòu)受到影響，經(jīng)TCA法脫蛋白的多糖復溶性變差，而且這種破壞作用隨著TCA濃度增大而增強[12]。綜合考慮，當TCA濃度為25%為佳，此時，蛋白質(zhì)清除率為78.94%，多糖保留率為7396%，此時綜合評分達到最大值。

2.2.2 Sevage法。

由圖2可得，隨著脫蛋白次數(shù)的增加，阿膠粗多糖蛋白去除率升高，多糖保留率逐漸減小。當利用Sevage法對阿膠多糖脫蛋白5次脫蛋白處理后，蛋白質(zhì)去除率僅為37.83%。經(jīng)過15次脫蛋白處理后脫蛋白率可增至79.38%，但是隨著脫蛋白次數(shù)的增加，蛋白去除率較之前增長不大，但多糖保留率卻逐漸下降。經(jīng)20次脫蛋白仍有蛋白質(zhì)殘留并且多糖保留率不高?？赡苁怯捎诎⒛z在熬制過程中，部分蛋白質(zhì)與阿膠多糖結(jié)合過于緊密或糖蛋白的存在[13]，或者多糖吸附在蛋白表面，重復操作造成多糖流失所致[14]。綜合考慮，處理15次時評分達到最大值，用Sevage試劑處理多次后，蛋白質(zhì)脫除率明顯提高，但多糖損失較多，影響多糖保留率。

2.2.3 蛋白酶法。

在底物濃度一定的情況下，酶解反應速度與木瓜蛋白酶濃度成正比。因此隨著酶濃度的增大，酶解反應速率提高。由圖3可知，隨著木瓜蛋白酶添加量的增加，阿膠多糖溶液的脫蛋白率逐漸增大，這可能是因為阿膠粗多糖溶液中的蛋白質(zhì)作為木瓜蛋白酶的作用底物，隨著酶濃度的增加，酶反應速率加快，蛋白質(zhì)脫除效果不斷上升[15]。當酶濃度大于500 U/mL時，酶用量的增加對脫蛋白率影響不大，多糖保留率隨著酶用量的增加呈緩慢降低趨勢?？赡苁怯捎诿敢堰_到飽和狀態(tài)，過量的酶聚集在有限的底物上，反而降低了酶的利用率[16]。從綜合評價來看，木瓜蛋白酶濃度為 500 U/mL時評分值達到最大，此時蛋白質(zhì)脫除率為29.97%，多糖保留率為72.57%。在阿膠粗多糖量一定的條件下，增大酶用量，酶解效率提高使得脫蛋白率增大。但考慮阿膠本身為水解蛋白，因此木瓜酶法脫蛋白亦不適用于阿膠粗多糖提取。

2.2.4 脫蛋白方法的比較。經(jīng)水提純沉法得到阿膠粗多糖，得率為43.3%。阿膠粗多糖經(jīng)3種不同純化方式脫蛋白（圖4），Sevage法蛋白脫除率為87.73%，多糖保留率為3214%，純化多糖蛋白質(zhì)去除率較高，多糖較純，但是其過程繁瑣;酶解法蛋白質(zhì)清除率為29.97%，多糖保留率為7257%，蛋白質(zhì)去除率不理想。考慮阿膠本身為水解蛋白，再次水解效果也不理想，相比較TCA蛋白質(zhì)清除率為7894%，多糖保留率為73.96%，此法簡單有效，可作為工業(yè)化生產(chǎn)方案。

2.3 酪氨酸酶活性抑制分析

通過阿膠多糖對酪氨酸酶的活性抑制能力來評價阿膠多糖的美白功效，阿膠多糖對酪氨酸酶活性抑制率如圖5所示。阿膠多糖對酪氨酸酶活性具有抑制作用，并呈一定的濃度依賴性。當阿膠多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時，對酪氨酸酶活性的抑制率達24.42%。因此，阿膠多糖具有抑制酪氨酸酶的活性、阻斷黑色素生成的能力。

3 結(jié)論

通過采用TCA法、Sevage法、木瓜蛋白酶法3種方法，對阿膠多糖脫蛋白方法進行比較，結(jié)果表明，TCA法的脫蛋白效果較好，蛋白質(zhì)清除率為78.94%，多糖保留率為73.96%;Sevage法次之，蛋白脫除率為87.73%，多糖保留率為3214%;蛋白酶法較差，蛋白質(zhì)清除率為29.97%，多糖保留率為72.57%。Sevage法純化多糖蛋白質(zhì)去除率較高，多糖較純且條件溫和，雖不會引起多糖的變性，但其采用的有機溶劑毒性較大，過程繁瑣，耗時耗能，考慮安全性和工業(yè)化生產(chǎn)程序不推薦該方法。酶解法除蛋白效率不高，考慮阿膠本身為水解蛋白，再次水解效果不理想，亦不推薦。TCA法能夠?qū)⒋蟛糠值鞍兹コ?，簡單可行。?jīng)初步純化制得的阿膠多糖對酪氨酸酶有一定的抑制作用，在濃度為1 mg/mL時，酪氨酸酶抑制率為24.42%。由此可見，經(jīng)該研究篩選的脫蛋白方法切實可行，制得的阿膠多糖具有良好的抑制酪氨酸酶作用，為阿膠多糖投入到食品、保健品以及化妝品生產(chǎn)提供理論參考。

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