黃偉華 顏梅新

摘要 [目的]對廣西賀州市荸薺種植區(qū)感染稈枯病的荸薺樣本進行病原分離鑒定及分析病原菌的侵染過程，為荸薺稈枯病的有效防治提供參考。[方法]以常規(guī)組織分離法對發(fā)病明顯的荸薺莖稈組織進行分離，采用傳統(tǒng)的形態(tài)學對病原菌進行鑒定。通過制備分生孢子懸浮液接種于載玻片上培養(yǎng)，測定分生孢子萌發(fā)情況。利用病菌孢子懸浮液對荸薺莖稈進行離體接種，檢測病菌的侵染過程。[結果]分離獲得1株病原分離物（Ceh），經形態(tài)學鑒定該病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。病菌分生孢子接種于載玻片后4 h開始萌發(fā)，8 h后大量萌發(fā)，12 h后形成大量附著孢，菌絲24 h后形成。病菌接種荸薺莖稈4 h后，分生孢子開始萌發(fā)并產生芽管;8 ～12 h芽管伸長，形成附著孢侵入荸薺莖稈表皮組織;24 h至7 d菌絲形成;接種8 d后，病菌在莖稈表面形成分生孢子盤。[結論]引起廣西賀州市荸薺種植區(qū)荸薺稈枯病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸薺稈枯病菌分生孢子萌發(fā)和侵染過程可用于病原菌和寄主互作機理研究。

關鍵詞 荸薺;稈枯病;Cylindrosporium eleocharidis;孢子萌發(fā);侵染過程

中圖分類號 S436.45 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0143-03

Abstract [Objective] Pathogen causing stem blight of Chinese water chestnut in Hezhou production zone in Guangxi was identified and infection process of casual organism was analyzed to provide scientific references for protection of Chinese water chestnut planting. [Method] Isolation of pathogen was carried out from the diseased tissues of stem of Chinese water chestnut， and identification of isolate was performed by morphological characteristics. Conidia suspension was prepared to inoculate on slides to test conidia germination and to inoculate on stem of Chinese water chestnut in vitro to analyze infection process of pathogen， respectively. [Result] One isolate strain named Ceh was obtained and identified as Cylindrosporium eleocharidis Lentz with its morphological characteristics. The conidia started to germinate after 4 h incubation and reached the peak of germination at 8 h incubation， whereas a large number of appressoria were formed after 12 h incubation. Hyphae development was observed after 24 h incubation. The conidia began to germinate after 4 h inoculation and produced germ tubes on stem. The germinal tubes could invade any tissues on the epidermis of the stem and form appressoria after 8 h to 12 h inoculation. Hyphae was formed to infected the host cells within 7 days and acervuli were developed on the stem surface after 8 days inoculation.[Conclusion] Stem blight of Chinese water chestnut was regard as causing by Cylindrosporium eleocharidis in Hezhou Chinese water chestnut growing area in Guangxi. Analysis of conidia germination and infection process of casual organism could be used for the study interaction between pathogen and host.

Key words Chinese water chestnut;Stem blight;Cylindrosporium eleocharidis;Conidia germination;Infection process

荸薺（Eleocharis dulcis）為莎草科（Cyperaceae）荸薺屬（Eleocharis）多年生草本植物，原產于我國和印度，在我國有2 000多年的栽培歷史。目前，荸薺主要栽培于我國長江流域及其以南各省，廣西則以桂林、賀州等地區(qū)廣泛種植;美國、菲律賓、越南、澳大利亞、日本等國亦有栽培[1-2]。荸薺球莖營養(yǎng)豐富，富含碳水化合物，可作為水果、蔬菜食用，亦具有藥用價值 [3-4]。然而荸薺在栽培過程中常受病害侵擾，其中以稈枯?。ㄋ追Q“荸薺瘟”）發(fā)生最為嚴重。該病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz），屬半知菌類黑盤孢目柱盤孢屬。該病主要危害葉鞘、葉狀莖、花器等部位，嚴重影響荸薺的產量和品質[5-7]。近年來筆者在廣西賀州荸薺產區(qū)調查發(fā)現(xiàn)，每年9—10 月是該地區(qū)荸薺稈枯病流行的季節(jié)，荸薺稈枯病已成為賀州荸薺產業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。當前關于荸薺稈枯病的研究較少，荸薺稈枯病于1962年在美國首次報道[8]。我國則于1985年在江蘇省報道荸薺稈枯病的發(fā)生[9]。隨后，廣西報道了荸薺稈枯病的發(fā)生與危害[10] 。通過對該病流行情況的分析，發(fā)現(xiàn)荸薺稈枯病的發(fā)生和流行與氣溫、濕度、降雨量、露水等環(huán)境因素密切相關，賴傳雅等[5]建立了預測模型（D=5.554 7-0.031X1+0049X2+0.523 3X3-0.348 7X4）。近年來，潘麗等[7]報道湖北省荸薺遭到稈枯病的危害，并對該病病原及生物學特性進行了研究。

賀州作為荸薺的主產區(qū)之一，未見關于荸薺稈枯病病原鑒定的報道。因此，為明確廣西賀州荸薺稈枯病病原分類地位和病原菌的侵染過程，筆者對賀州市荸薺種植區(qū)感染稈枯病的荸薺進行病原分離鑒定及分析病原菌的侵染過程，以期為有效防治荸薺稈枯病和研究病原菌與寄主互作提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

荸薺稈枯病樣本于2016 年8月采集于廣西賀州市荸薺栽培區(qū)。

1.2 方法

1.2.1 荸薺稈枯病病原菌分離。

病原菌分離采用常規(guī)的組織分離法[11]。從病健交界處切取5 mm×5 mm的小塊，經表面消毒（ 75%乙醇10 s，0.1%升汞1 min，無菌水沖洗2～3 次）后移入馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂（PDA）培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)5 d，待菌絲在平板上長出后，挑取菌落邊緣單菌絲的尖端移入不加抗生素的PDA 培養(yǎng)基上進行純化，將純化后的菌株移至 PDA 斜面上，放入4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌的致病性測定。

致病力測定參照趙玳琳等[12]的方法，稍作修改。選取健康、大小一致的荸薺莖稈，經75%乙醇表面消毒后剪取莖稈約20 cm長，放置于鋪有濕潤吸水紙的塘瓷盤中，荸薺莖稈兩端采用濕潤的吸水紙覆蓋保濕。用直徑6 mm的打孔器在PDA平板上培養(yǎng)7 d的病菌菌落邊緣打孔，提取菌絲塊接種至針刺過的莖稈上，無菌培養(yǎng)基塊接種設為對照，蓋上蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個處理各5根莖稈，每根莖稈設2個接種點。7 d 后觀察發(fā)病情況。對接種發(fā)病的荸薺莖稈組織進行病原菌再分離，觀察分離物是否與接種菌株一致。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定。

將分離純化獲得的菌株在PDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)5 d后，切取菌落邊緣的菌絲塊移至PDA培養(yǎng)基中央，放置生化培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)15 d，觀察菌落形態(tài)，通過光學顯微鏡（carl zeiss）觀察菌株的菌絲、分生孢子、分生孢子盤等形態(tài)特征。病原菌的鑒定根據病害癥狀、病菌菌落形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗及分生孢子盤形態(tài)，參照魏景超[13]對柱盤孢屬和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對荸薺柱盤孢菌的形態(tài)特征描述進行病原鑒定。

1.2.4 病原菌分生孢子萌發(fā)。

病菌在PDA平板上培養(yǎng)15 d后，吸取5 mL無菌水滴在PDA平板上的菌落表面，用無菌接種環(huán)刮取菌絲，采用2層擦鏡紙過濾菌絲獲得分生孢子懸浮液，用血球計數板將分生孢子懸浮液濃度調至107 個/mL，然后吸取分生孢子懸浮液滴至載玻片上，蓋上蓋玻片，將其放入鋪有吸水紙的9 cm培養(yǎng)皿中，蓋上皿蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，接種后分別于4、8、12和24 h在光學顯微鏡下觀察分生孢子萌發(fā)情況。

1.2.5 病原菌侵染過程。

病菌孢子懸浮液配制同“1.2.4”。選取健康的荸薺莖稈，經75%乙醇表面消毒后剪取莖稈約20 cm長，放置于鋪有濕潤吸水紙的塘瓷盤中，荸薺莖稈兩端采用濕潤的吸水紙覆蓋保濕。將上述配好的濃度為107 個/mL 孢子懸浮液接種至荸薺莖稈表面上，無菌水接種設為對照，蓋上皿蓋子，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，接種后分別于4 h、8 h、12 h、24 h、2～8 d剪取接種部位，制成玻片在光學顯微鏡下觀察病菌侵染情況。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

荸薺稈枯病主要危害莖稈，初為暗綠色不規(guī)則水漬狀斑，后擴展形成棱形或橢圓形至不規(guī)則暗綠色斑，病莖變軟凹陷，其上產生小黑點，之后愈合形成較大的病斑，重者整株枯死、倒伏（圖1A）。

2.2 病原菌的形態(tài)特征

從表現(xiàn)明顯癥狀的荸薺莖稈組織分離純化獲得1菌株，命名為Ceh。在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，菌落中間為墨綠色，氣生菌絲絨毛狀，菌落邊緣整齊。15 d后開始產孢，分生孢子無色，線形，無分隔，中間稍寬，基部稍鈍圓，直，向一側或不規(guī)則彎曲，分生孢子大小為36.0～107.32 μm×3.34～8.86 μm（圖1D）;分生孢子梗無色或淺褐色，叢生，瓶形、梨形或窄卵形，無分隔，大小為6.78～28.25 μm×3.25～9.25 μm。經致病性試驗，所引起的癥狀與原癥狀相似（圖1B），從接種發(fā)病的組織處再分離獲得的分離物與田間發(fā)病組織分離的病原菌形態(tài)一致。根據病菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，參照魏景超[13]的分類方法和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對荸薺柱盤孢菌的特征描述，將菌株Ceh鑒定為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。

2.3 荸薺稈枯病菌孢子萌發(fā)

荸薺稈枯病菌分生孢子懸浮液接種至蓋玻片上4 h后開始萌發(fā)，分生孢子兩端形成1個或2個芽管，無附著孢產生（圖2A）;接種8 h后分生孢子大量萌發(fā)，芽管伸長，產生圓形或橢圓形附著孢（圖2B）;接種12 h產生大量附著孢，顏色為深褐色或黑色（圖2C）;24 h后菌絲形成（圖2D）。

2.4 荸薺稈枯病菌侵染寄主的過程

荸薺稈枯病菌分生孢子在接種至荸薺莖稈表面4 h后分生孢子開始萌發(fā)，芽管形成（圖3A）;接種8～12 h芽管伸長，侵入荸薺莖稈表皮組織，然后在莖稈表面形成深褐色附著孢（圖3B，箭頭所示）;24 h（l d）～7 d后，病菌菌絲形成，侵入寄主組織細胞并在細胞間蔓延（圖3C、D，箭頭所示）;接種8 d后分生孢子盤和大分生孢子出現(xiàn)（圖3E）;接種20 d后，菌絲和分生孢子消融，分生孢子盤與寄主組織形成病殘體（圖3F）。

3 討論

荸薺稈枯病是我國荸薺最重要的病害之一，嚴重影響荸薺的產量和品質[7-10]。近年來，有報道稱Phoma bellidis也可導致荸薺莖稈枯萎，其所致癥狀與C.eleocharidis引起的癥狀稍有不同，該病在湖北零星發(fā)生，是一種新病害[14]。參照魏景超[13]的分類方法和Lentz[8]、李清銑等[9]、賴傳雅等[10]、潘麗等[7]對荸薺柱盤孢菌的特征描述，確定了賀州地區(qū)荸薺稈枯病病原菌為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。該研究分離獲得菌株Ceh的分生孢子梗和分生孢子的大小與賴傳雅等[10]分離的菌株接近，可能是因為這兩者均來自廣西荸薺種植區(qū)。另外，筆者試圖通過其DNA序列分析（數據未顯示）對荸薺稈枯病菌進行鑒定。然而，ITS序列分析表明，該菌序列與GenBank中炭疽菌屬分離物核苷酸序列相似性為94%～96%，但兩者在形態(tài)特征上存在明顯差異，可能是因為在世界范圍內荸薺稈枯病菌的研究較少。

C.eleocharidis接種載玻片4 h后，分生孢子開始萌發(fā)，8 h后達到萌發(fā)高峰，12 h后形成大量的附著孢。在真菌膠孢炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）[15]中也獲得類似的結果。C.eleocharidis分生孢子接種荸薺莖稈4 h后開始萌發(fā)，在莖稈表面上產生芽管。接種8～12 h后，芽管可從荸薺莖稈表皮任何組織侵入，形成附著孢。7 d內形成菌絲，侵染宿主細胞，接種8 d后在莖面上形成分生孢子盤。這些研究結果與對稻瘟病（magnaporthe oryzae）[16]和膠孢炭疽病菌（Colletrichum gloeosporioides）[17]孢子萌發(fā)和侵染過程相似。

近幾年來，隨著荸養(yǎng)種植面積的擴大和連作，荸薺種莖的頻繁調運，荸薺稈枯病日趨嚴重。由于該病的致病機理尚不清楚，對現(xiàn)有技術仍遠不能達到有效地遏制該病蔓延和傳播的要求。因此，從不同角度、以不同方法去研究和發(fā)展新的控制該病的技術十分必要，未來的研究工作將建立荸薺稈枯病菌遺傳轉化體系，研究該病原菌的致病機理，為該病害新的防治技術提供靶標基因。

4 結論

引起廣西賀州市荸薺種植區(qū)荸薺稈枯病病原為荸薺柱盤孢菌（Cylindrosporium eleocharidis Lentz）。荸薺稈枯病菌分生孢子萌發(fā)和侵染過程的研究可用于病原菌和寄主互作機理研究，為荸薺稈枯病菌的防治提供理論依據。

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