張玉 汪宏濤 劉嘉荔

摘要 DNA甲基化是發(fā)生在基因5′端5′-CpG-3′胞嘧啶上的DNA共價修飾作用，可調(diào)節(jié)基因轉錄，與植物的生長、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關系。DNMT2是首先從擬南芥中發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉移酶。該研究通過NCBI序列比對獲得番茄中DNMT2的同源基因SlDNMT2的編碼區(qū)序列;通過Primer5設計引物，PCR技術擴增獲得SlDNMT2基因高度特異性序列（長度約500 bp）;利用一系列分子生物學試驗研究方法最終成功構建SlDNMT2 RNAi表達載體，并命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。該RNAi表達載體的構建為進一步探究SlDNMT2基因在植物生長發(fā)育過程中的功能奠定了一定的理論基礎并提供了一條高效、迅速的載體構建途徑。

關鍵詞 番茄;DNA甲基化;SlDNMT2;RNAi;載體構建

中圖分類號 Q5-33 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2020）03-0097-04

Abstract DNA methylation is a covalent modification of DNA that occurs at the 5′CpG3′ cytosine at the 5′ end of the gene，it regulates gene transcription and is closely related to plant growth， development， maturation and aging.DNMT2 is a key enzyme in DNA methylation which was found in Arabidopsis. In this study， firstly， the sequence of the coding region of SlDNMT2 was obtained by NCBI sequence alignment. And then the highly specific sequences of SlDNMT2 gene were acquired by polymerase chain reaction， and the primers were designed by Primer 5. Finally， taking advantage of a series of molecular biological experiment study methods，the SlDNMT2 RNAi expression vector was constructed successfully， and named PBI12135S∷siRNA1siRNA2. The construction of the RNAi expression vector not only laid the theoretical foundation for further exploring the SlDNMT2 genes function in plant growth and development stage but also provided an efficient and rapidly way of vector construction.

Key words Tomato;DNA methylation;SlDNMT2;RNAi;Construction of vector

番茄（Solanum lycopersicum）屬茄科番茄屬植物，是一種草本植物[1]，其最早發(fā)源于南美洲，17世紀傳入亞洲。直至18世紀，番茄開始被作為食用植物栽培，此外番茄還具有一定藥用價值[2]。至今，番茄被廣泛種植于世界各地，具有重要研究意義。DNMT（DNA methyltransferase，DNMTs）是植株DNA甲基化過程中重要的甲基轉移酶。真核生物中有3種DNA甲基轉移酶，分別命名為DNMT1、DNMT2、DNMT3（DNMT3a和DNMT3b）[3]。DNMT1是一種維持DNA甲基化穩(wěn)定性的酶;DNMT2是植物中特有的一種甲基轉移酶，其通過與DNA結構特異位點結合而發(fā)揮特定作用，但具體機制研究尚少;DNMT3a和DNMT3b在DNA甲基化過程中發(fā)揮重要作用，可使去甲基化的胞嘧啶位點重新發(fā)生甲基化過程[4]。DNA甲基化是一種常見的DNA共價修飾作用，生物體在DNA甲基轉移酶的催化下，以S-腺苷-L-甲硫氨酸（S-adenosyl methionine，SAM）為輔酶，將甲基轉移到特定的堿基上[5]。這種共價修飾通常發(fā)生在基因5′端5′—CpG—3′胞嘧啶上。DNA甲基化修飾可以調(diào)節(jié)基因轉錄，與植物的生長、發(fā)育、成熟、衰老有著密切關系[6]。

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由于雙鏈RNA導致的基因沉默現(xiàn)象。RNA沉默是一種通過形成雙鏈RNA，特異性剔除或關閉目的基因表達的技術[7-9]。RNA干擾技術在進化上具有保守性，該技術將與目的基因mRNA序列同源互補的雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）轉入植物細胞，植物細胞與dsRNA迅速發(fā)生應答反應，在核酸內(nèi)切酶作用下，將dsRNA切割成許多特定的小干擾RNA序列（small interfering RNA，siRNA）[10]。在RNA解旋酶的作用下，siRNA發(fā)生解鏈作用，反義siRNA與核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶、RNA解旋酶結合，進一步形成RNA沉默復合物（RNA-induced silencing complex，RISC）[11]。RISC可與外源性mRNA同源序列發(fā)生特異性結合作用，對mRNA進行切割，而后降解斷裂的mRNA。此外，在RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下，siRNA還可以結合植物體內(nèi)靶RNA，形成更多新的dsRNA，新dsRNA由核酸內(nèi)切酶切割，進一步產(chǎn)生許多次級siRNA[12-14]，從而使RNA干擾的作用逐級放大，以期達到完全降解靶mRNA的效果，最終產(chǎn)生相應的功能表型缺失。

該研究通過NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄植株DNMT2基因編碼序列（coding sequence，CDS），通過序列保守性分析獲得目的基因的高度特異性序列，PCR擴增該高度特異性序列。利用限制性內(nèi)切酶切割pSK載體和特異性序列片段，經(jīng)轉化，陽性鑒定以及關鍵性發(fā)夾結構驗證，最終獲得番茄植株DNMT2基因RNAi表達載體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。

番茄植株是由實驗室繁殖保存的來自美國康奈大學植物研究所的野生型番茄（Solanum lycopersicum Mill.cv.Ailsa Craig）。

1.1.2 菌株和質(zhì)粒。

大腸桿菌（Escheriachia coli）DH5α、根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHAl05、植物表達載體pBI121、PSK均保存于實驗室-80 ℃冰箱。

1.1.3 試劑。

限制性內(nèi)切酶、Taq酶、高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase、Trizol（購自Invitrogen公司）、反轉錄試劑盒（購自TOYOBO公司）。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒（購自Omega公司），引物由上海生工技術有限公司合成，測序由金唯智技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 植物總RNA提取。

利用試劑盒和Trizol試劑法提取番茄植物總RNA。操作過程：①取樣，每100 mg組織中加入1 mL TP1溶液。②渦旋振蕩，4 ℃離心，12 000 r/min，5 min。③取上清，加入等體積TPII溶液，顛倒混勻;加入1/4體積氯仿，顛倒混勻，室溫靜置5 min。④4 ℃離心，12 000 r/min，5 min，取上清，加入等體積異丙醇，顛倒混勻，室溫靜置10 min。⑤4 ℃離心，12 000 r/min，10 min，1 mL 75%乙醇清洗2次。⑥通風櫥干燥處理后加入30～40 μL RNA溶解沉淀，后通過瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA質(zhì)量，最后將樣品保存于-80 ℃冰箱備用。

1.2.2 mRNA反轉錄。

利用反轉錄試劑盒對提取的mRNA反轉錄獲得番茄植株cDNA。操作步驟：在20 μL體系中加入如下試劑：①mRNA X μL。②Accurt Reaction Mix（4X）2 μL。③Nudease-Free H2O（8-X） μL。④42 ℃靜置2 min。⑤依次加入：Accurt Reaction stopper（5X）2 μL，5XAu-In-Due-RT-Master Mix 4 μL，Nudease-Free H2O 6 μL。反轉錄PCR反應程序為25 ℃ 10 min;42 ℃ 50 min;85 ℃ 5 min。⑥儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設計和PCR擴增。

利用Primer 5軟件設計引物，表1為該研究中所需主要引物。利用PCR技術，擴增得到SlDNMT2基因。SlDNMT2目的基因PCR擴增程序為95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;引物溫度（℃） 30 s;72 ℃ T（依據(jù)片段長度設定時間，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。SlDNMT2基因特異性序列PCR擴增程序為94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s;引物溫度（℃） 30 s;72 ℃ T（依據(jù)片段長度設定時間，min）;72 ℃ 10 min;12 ℃ 60 min。

1.2.4 番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達載體的構建。

利用限制性內(nèi)切酶處理pSK-siRNA1-siRNA2陽性菌重組質(zhì)粒和pBI121質(zhì)粒，經(jīng)Omega公司膠回收試劑盒回收siRNA1-siRNA2高度特異性片段，T4 DNA連接酶4 ℃過夜連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，陽性菌鑒定，最終得到番茄植株SlDNMT2基因RNAi表達載體，并將該載體重新命名為pBI121-35S∷siRNA1-siRNA2。載體構建流程見圖1。

2 結果與分析

2.1 目的基因siRNA序列克隆及檢測

2.1.1 SlDNMT2基因生物信息學分析。

通過NCBI網(wǎng)站Blast獲得番茄DNMT2基因的編碼區(qū)，其CDS全長為1 146 bp，共編碼381個氨基酸。利用Trizol試劑法提取番茄植物總RNA，質(zhì)量檢測結果如圖2所示。將SlDNMT2基因氨基酸序列與擬南芥AtDNMT2進行同源性比對分析，結果顯示番茄SlDNMT2和擬南芥AtDNMT2的同源性達62.05%（圖3）。并選取SlDNMT2基因起始密碼子（ATG）至終止密碼子（TGA）的編碼區(qū)，利用SGN-VIGS網(wǎng)站，在Solanum_lycopersicum_ITAG _v2.40資料庫中篩選，最終獲得大小約500 bp的SlDNMT2基因高度特異性序列，并命名為小干擾RNA序列（siRNA）。

2.1.2 SlDNMT2基因特異性片段克隆。

以LeDNMT2-F和LeDNMT2-R為引物PCR擴增獲得SlDNMT2目的基因片段。而后將SlDNMT2目的基因的PCR產(chǎn)物作為模板，以LeDNMTRi-F1、LeDNMTRi-R1、LeDNMTRi-F2、LeDNMTRi-R2為引物，利用PCR技術獲得SlDNMT2的高度特異性序列（siRNA），PCR結果如圖4所示。

2.2 陽性菌鑒定

2.2.1 siRNA1特異性序列陽性鑒定。

限制性內(nèi)切酶Xho I、Hind Ⅲ酶切pSK載體和特異性序列1（siRNA1），T4 DNA Ligase 4 ℃過夜連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，菌落PCR陽性鑒定。鑒定結果如圖5所示，并獲得1號陽性菌質(zhì)粒用Xho I、Hind Ⅲ酶切獲得siRNA1片段，在瓊脂糖凝膠電泳下檢測，結果如圖6所示。泳道1內(nèi)可以觀察到一條大小約500 bp的特異性條帶，送金唯智技術有限公司測序，經(jīng)DNAMAN軟件比對，測序結果正確。

2.2.2 siRNA2特異性序列陽性鑒定。

限制性內(nèi)切酶Sac I、EcoR I酶切上述1號陽性菌質(zhì)粒和特異性序列2（siRNA2），T4 DNA Ligase 4 ℃過夜連接，轉化DH5α大腸桿菌感受態(tài)，經(jīng)堿裂解法質(zhì)?？焯彡栃澡b定，瓊脂糖凝膠電泳分析結果如圖7所示，獲得16號陽性菌質(zhì)粒。分別用Sac I、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切以及Xho I、EcoR I限制性內(nèi)切酶酶切獲得siRNA2片段（泳道1）及siRNA1-siRNA2片段（泳道2），瓊脂糖電泳檢測結果如圖8所示，送金唯智技術有限公司測序，經(jīng)DNAMAN軟件比對，測序結果正確。

2.3 發(fā)夾結構的驗證

限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切上述16號陽性菌質(zhì)粒，膠回收試劑盒回收siRNA1、siRNA2特異性片段，利用純化試劑盒純化后，進行發(fā)夾結構驗證。經(jīng)95 ℃熱處理5 min后，分別自然退火（22 ℃）和冰上退火（4 ℃）30 min，在0.8%瓊脂糖凝膠電泳下檢測發(fā)夾結構的正確性，檢測結果如圖9所示。不同處理條件下，2個泳道內(nèi)均能檢測到特異性條帶，且條帶大小正確。

2.4 DNA甲基化轉移酶SlDNMT2基因RNAi表達載體正確性檢測

限制性內(nèi)切酶Xho I、EcoR I酶切pBI121-siRNA1-siRNA2陽性菌質(zhì)粒，經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)電泳條帶的顯色位置，以確定SlDNMT2基因RNAi表達載體構建的正確性，酶切后電泳結果如圖10所示，4個陽性重組質(zhì)粒經(jīng)酶切后均能獲得大小約1 200 bp的特異性條帶。

3 結論與討論

3.1 RNA干擾技術中特異性序列的選擇

在構建SlDNMT2RNAi表達載體的過程中關鍵是特異性序列的選擇，該研究通過NCBI網(wǎng)站序列比對作用，選擇番茄植株編碼區(qū)內(nèi)高度特異性序列（約500 bp）設計引物，進而添加酶切位點，最終通過PCR技術擴增獲得了SlDNMT2基因高度特異性序列。

3.2 RNAi表達載體構建中陽性鑒定

利用RNA沉默技術構建RNAi表達載體。在此過程中，發(fā)夾結構的鑒定是構建 pBI12135S∷siRNA1-siRNA2表達載體是否成功的關鍵。

根據(jù)重組質(zhì)粒pBI12135S∷siRNA1-siRNA2與空載pBI121載體質(zhì)粒分子量大小不同，其在1%瓊脂糖凝膠中的遷移速率不同，通過質(zhì)?？焯嵩囼炶b定陽性菌;利用限制性內(nèi)切酶酶切，膠回收，不同退火溫度處理后，在瓊脂糖凝膠電泳下檢測發(fā)夾結構，根據(jù)DNA條帶的位置驗證發(fā)夾結構正確性，最終，成功構建植物SlDNMT2基因RNAi表達載體。

3.3 RNA干擾技術的意義與前景

RNA沉默技術是分析基因功能的有效途徑之一。通過RNA干擾能特異性阻斷目的基因的表達，獲得缺失特定功能的RNAi突變體，進而對目的基因的功能進行分析[15]。RNAi技術為分析目的基因的功能提供了一種快速、高效的途徑。

參考文獻

[1] DE PABLO VALENCIANO J P，URIBE TORIL J.Control system of management for intensive cultivation activity in tomato production：Spanish case[J].Journal of agricultural science & technology，2018，17（1）：11-21.

[2] ZHANG Y T，ZHANG Y Q，YANG Q C，et al.Overhead supplemental farred light stimulates tomato growth under intracanopy lighting with LEDs[J].Journal of integrative agriculture，2019，18（1）：62-69.

[3] QIU J，ZHANG Y N，ZHENG X W，et al.Notch promotes DNMTmediated hypermethylation of Klotho leads to COPDrelated inflammation[J].Experimental lung research，2018，44（7）：368-377.

[4] RHEE I，BACHMAN K E，PARK B H，et al.DNMT1 and DNMT3b cooperate to silence genes in human cancer cells[J].Nature，2002，416（6880）：552-556.

[5] KUNERT N，MARHOLD J，STANKE J，et al.A Dnmt2like protein mediates DNA methylation in Drosophila[J].Development，2003，130（21）：5083-5090.

[6] OKANO M，BELL D W，HABER D F A，et al.DNA methyltransferases Dnmt3a and Dnmt3b are essential for de novo methylation and mammalian development[J].Cell，1999，99（3）：247-257.

[7] TASSETTO M，KUNITOMI M，ANDINO R.Circulating immune cells mediate a systemic RNAibased adaptive antiviral response in Drosophila[J].Cell，2017，169（2）：314-325.

[8] ZAMORE P D，TUSCHL T，SHARP P A，et al.RNAi：Doublestranded RNA directs the ATPdependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals[J].Cell，2000，101（1）：25-33.

[9] 伍國強，劉海龍，李勝勝，等.甜菜內(nèi)向整流K+通道BvAKT1基因RNAi載體的構建[J].分子植物育種，2019，17（1）：112-118.

[10] 潘琦，岳建蘇，王翠倫，等.桔小實蠅鈉離子通道基因和P450基因RNAi載體構建及轉化[J].分子植物育種，2019，17（2）：471-477.

[11] PAN Y，DONG Y，WANG R X，et al.Generation of a promising universal RNAi vector system to control plant pests[J].Acta physiologiae plantarum，2019，41（1）：18.

[12] SMITH J A，WHITE E A，SOWA M E，et al.Genomewide siRNA screen identifies SMCX，EP400，and Brd4 as E2dependent regulators of human papillomavirus oncogene expression[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，2010，107（8）：3752-3757.

[13] CHAUDHARY S，DUTTA T K，SHIVAKUMARA T N，et al.RNAi of esophageal glandspecific gene Mimsp1 alters early stage infection behaviour of rootknot nematode，Meloidogyne incognita[J].Journal of general plant pathology，2019，85（3）：232-242.

[14] ZOU L N，WU D，ZANG X，et al.Construction of a germlinespecific RNAi tool in C.elegans[J].Scientific reports，2019，9（1）：1-10.

[15] DAVIS E，CAIMENT F，TORDOIR X，et al.RNAimediated allelic transinteraction at the imprinted Rtl1/Peg11 locus[J].Current biology，2005，15（8）：743-749.