譚舒波，徐麗，劉瀟鋒

一株磷酸鹽還原菌除磷的特性研究

譚舒波，徐麗，劉瀟鋒

（沈陽建筑大學(xué) 環(huán)境工程系，遼寧 沈陽 110168）

在厭氧-缺氧環(huán)境下，從污水處理廠的厭氧池中篩選出一株高效的磷酸鹽還原菌，命名為 YING18。對該菌株進(jìn)行了生理生化研究及 16SrDNA 序列分析，并對該菌株的除磷效率和影響除磷特性的因素進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示：磷酸鹽濃度可以影響微生物的磷酸鹽還原能力，隨著磷濃度的增高，磷酸鹽還原菌的生長速率會加快，磷的去除量會增加，碳磷比為150∶1時最佳，四種微量元素的最佳配比： Mo為100 mg/L、Ni為20 mg/L、Co為100 mg/L、Fe為50 mg/L，發(fā)現(xiàn) Mo 元素對磷酸鹽還原菌的影響效果最大，其次是 Ni、Co 和 Fe。

磷酸鹽還原菌；磷濃度；微量元素

磷酸鹽可以在一定條件下被還原成磷化氫氣體，這為除磷工藝提供便捷，但是很少報道磷酸鹽還原菌的生長和除磷特性。為了讓人們了解磷酸鹽還原菌的除磷能力和生長特性，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)厭氧反應(yīng)為理論基礎(chǔ)，在厭氧環(huán)境下，選取有磷酸鹽還原菌的污泥作為種泥，通過馴化和富集，分離出功能細(xì)菌，并對分離出的磷酸鹽還原菌進(jìn)行除磷能力和生長特性的研究，愿為除磷工藝提供新思路。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種

接種污泥取自污水處理廠中厭氧池，含水率約為 98%，pH 為 7.4，MLSS 質(zhì)量濃度為 4.53 g/L，MLVSS 質(zhì)量濃度為2.36 g/L。

1.1.2 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基成分：葡萄糖作為碳源，氯化銨作為氮源，磷酸氫二鈉作為磷源，其他參見具體方案。

富磷發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O60.9 g，Na2PO4·12H2O 0.46 g，NH4Cl 0.76 g，微量元素共0.3 mL ，配比見表 1。

表1 微量元素質(zhì)量濃度

1.2 實(shí)驗(yàn)方案

1.2.1 污泥馴化

污泥取自撫順三寶屯污水處理廠的厭氧池內(nèi)，進(jìn)行污泥濃度調(diào)整，大約3 750 mg/L ，進(jìn)行觀察，每兩天測定PO43--P去除率、COD以及磷化氫的產(chǎn)量[1]-[4]，據(jù)此判斷污泥的馴化程度。

1.2.2 菌株的分離提純及篩選

待裝置中運(yùn)行狀態(tài)穩(wěn)定后，取含馴化富集的磷酸鹽還原菌活性污泥，進(jìn)行菌種分離的方法為涂布接種法。在30 ℃的溫度下培養(yǎng) 3～5 d ，看到分散菌落，在10-5、10-6濃度的培養(yǎng)皿內(nèi)菌落密度較為適宜。重復(fù)劃線 4～5 次，結(jié)合對菌落的觀察和革蘭氏染色的結(jié)果，選出菌株，在三角燒瓶中裝入配置好的液體培養(yǎng)基，吹入氮?dú)馀懦諝猓?21 ℃滅菌 20 min，冷卻放置。在30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)純化后的細(xì)菌24 h，進(jìn)行富集培養(yǎng)[5]-[7]。

菌株初篩后將得到的細(xì)菌分別接種于含磷發(fā)酵培養(yǎng)基的厭氧管中（PO43--P 為 10 mg/L）記錄細(xì)菌的顏色、邊緣、透明度等形態(tài)，包括革蘭氏染色后的形態(tài)，培養(yǎng) 3 d 后，挑選出6 株去除率超出 20%的細(xì)菌進(jìn)行磷化氫產(chǎn)氣的實(shí)驗(yàn)，再將具有除磷能力良好的細(xì)菌接種于磷化氫檢測裝置中進(jìn)行復(fù)篩[8，9]。

1.2.3 菌株的鑒定

（1）凝膠成像：實(shí)驗(yàn)中采用TaKaRa 試劑盒，將基因組 DNA 純化取出備用，方法可見試劑盒說明書。將 4 μL的 PCR 擴(kuò)增后的 DNA 液與分于硫酸紙上的N 滴 6×loading buffer 混合均勻。并用移液槍將混合后的液體打入凝膠槽點(diǎn)樣孔中。注意注入5 μL marker-dl2000于第一個和最后一個槽孔中，在電泳儀上運(yùn)行，并在凝膠成像儀的載物臺中央?yún)^(qū)域放置凝膠，運(yùn)行并拍照保存。

（2）PCR測序：使用 TaKaRa 試劑盒，將基因組 DNA 純化后提取出來備用[10]。16SrDNA 擴(kuò)增的引物分別為:CHPN856-01 正向引物；CHPN856- 02 反向引物；94 ℃中持續(xù)3 min；之后在94 ℃、55 ℃、72 ℃中各停留30 s， 共 30 個循環(huán)；之后在72 ℃中停留5 min；4 ℃終止保存。PCＲ 產(chǎn)物外送進(jìn)行測序。

1.3 磷酸鹽還原菌特性實(shí)驗(yàn)研究

1.3.1 磷濃度對細(xì)菌的生長和除磷性能的影響

細(xì)菌接入磷源濃度分別為10、20、30 mg/L的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后在30 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中以120 r/min培養(yǎng)，每隔6 h取樣測定菌液濃度和菌液中總磷的濃度。

1.3.2 碳磷比對細(xì)菌的生長和除磷性能的影響

細(xì)菌接入碳磷比調(diào)整為50∶1、80∶1、100∶1、120∶1、150∶1的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，其中磷酸鹽濃度為10 mg/L，并置于30 ℃,120 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每6 h取樣測定菌液中總磷的濃度和菌液濃度。

1.3.3 微量元素及配比對細(xì)菌的除磷性能和生長的影響

富磷發(fā)酵培養(yǎng)基：C6H12O60.9 g，Na2PO4·12H2O 0.46 g，NH4Cl 0.76 g，微量元素共0.3 mL。本實(shí)驗(yàn)選取Mo、Ni、Co、Fe 4種元素，通用正交法分析實(shí)驗(yàn)，采取Mo、Ni、Co、Fe四因素，20、50、100 μg/L三水平，具體如表2。

表2 微量元素濃度

按照正交實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)表的方法，實(shí)驗(yàn)安排如表3所示。

表3 實(shí)驗(yàn)編號

細(xì)菌濃度測定：吸取反應(yīng)完成后水樣，使用分光光度計測定菌液的吸光度值波長為600 nm，以空白樣為空白培養(yǎng)基，此時菌液的吸光度值表示混合液中細(xì)菌的濃度。其他檢測方法見表4。

表4 檢測方法

2 結(jié)果與討論

2.1 污泥訓(xùn)化及菌株的分離純化篩選

通過調(diào)節(jié)反應(yīng)器 pH、營養(yǎng)比例及溫度，得到較為理想的水平的污泥。分離純化是通過涂布接種法，最終有22株菌株，以上述方法在富磷培養(yǎng)基和預(yù)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并測定除磷率，發(fā)現(xiàn) YING18 菌株除磷率較高，進(jìn)行下一步研究。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 凝膠成像電泳結(jié)果

圖1 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳成像圖

對 YING18 菌DNA提純并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到 DNA 片段，圖 1為對 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖片。將 marker-dl2000 標(biāo)準(zhǔn)條帶與結(jié)果比對，發(fā)現(xiàn)條帶清晰明亮，無雜質(zhì)。

2.2.2 PCR測序結(jié)果

經(jīng)過 Blast 對比，得出菌株 YING18與在NCBI 上登錄號為 Enterobacter sp.KC736654.1相似度為 99%，是最高的，是腸桿菌屬。

2.3 磷酸鹽還原菌特性實(shí)驗(yàn)

2.3.1 磷濃度對細(xì)菌的生長和除磷性能的影響

榮宏偉等人發(fā)現(xiàn)磷濃度會影響微生物的群落結(jié)構(gòu)[11]。由此探究磷濃度與YING18菌生長之間的作用，設(shè)置實(shí)驗(yàn)濃度為10、20、30 mg/L三個濃度梯度，將磷酸鹽分別接種于6個厭氧管中，調(diào)整pH為8，溫度為30 ℃。如圖2所示為不同磷酸鹽濃度下，磷酸鹽還原菌的生長曲線。

圖2 磷濃度對磷酸鹽還原菌生長的影響

如圖2所示，在三種初始磷濃度為10、20、30 mg/L的磷源培養(yǎng)基中，細(xì)菌的數(shù)量在40 h以后達(dá)到最大值，說明細(xì)菌生長引起了培養(yǎng)基吸光度的變化。不同培養(yǎng)基中，判定對細(xì)菌生長有利到不利三種初始磷濃度的依據(jù)為細(xì)菌達(dá)到穩(wěn)定期的先后順序，結(jié)果為：30 mg/L>20 mg/L>10 mg/L。

由上可知，磷源對菌株的生長速度有影響，而磷濃度是否促進(jìn)磷酸鹽還原的效率還有待研究。因此，為加強(qiáng)對不同磷酸鹽濃度與磷酸鹽還原菌除磷效果關(guān)系的了解，本實(shí)驗(yàn)磷源選擇磷酸氫二鈉10、20、30 mg/L，在6個厭氧管中分別接種三個濃度梯度的磷酸鹽，pH調(diào)整為8，溫度調(diào)整至30 ℃。連續(xù)培養(yǎng)48 h，測定TP的含量，注意用0.22 μm的微孔濾膜過濾上清液，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表5所示。

表5 磷濃度對磷酸鹽還原菌除磷的影響

由表5可知，培養(yǎng)基內(nèi)升高磷濃度，能夠使磷酸鹽去除率減低，因?yàn)榕囵B(yǎng)基中磷的逐漸增加，已超出微生物所需的磷，而微生物的除磷能力是有限的，碳源雖已遠(yuǎn)超上限，但微生物的去除率卻不能上升。而在不同濃度下磷的增加，會使微生物去除磷酸鹽的總量得到了提升，從濃度為10 mg/L去除了3.28 mg/L到濃度為30 mg/L去除了3.67 mg/L，雖然微生物的除磷率在下降，但是對磷酸鹽的還原能力有所提升。

2.3.2 碳磷比對細(xì)菌的生長和除磷性能的影響

孫亮等人在研究磷化氫釋放過程中發(fā)現(xiàn)，磷化氫的產(chǎn)氣量受不同碳磷比這一條件影響[12]。本實(shí)驗(yàn)碳磷比設(shè)置為50∶1、80∶1、100∶1、120∶1、 150∶1，在厭氧管中接種5個碳磷比濃度梯度的磷酸鹽，pH調(diào)整為8，溫度調(diào)整至30 ℃。如圖3所示，在不同碳磷比條件下的磷酸鹽還原菌生長曲線。

圖3 碳磷比對磷酸鹽還原菌生長的影響

如圖3所示，在30 h后培養(yǎng)基中的細(xì)菌濃度在陸續(xù)增加，數(shù)量最高值也因碳磷比不同而有差異。由圖中生長趨勢可知，5種培養(yǎng)基中的細(xì)菌在30 h前生長速率相差不大，但隨后在培養(yǎng)基中的最大細(xì)菌濃度因碳磷比的增大而增加，當(dāng)碳磷比為150∶1時，最大的細(xì)菌濃度為2.12；最小的細(xì)菌濃度僅為1.10，此時的碳磷比為50∶1 。

為對磷酸鹽還原菌受碳磷比影響這一現(xiàn)象的研究，實(shí)驗(yàn)如下設(shè)置，碳磷比取50∶1、80∶1、 100∶1、120∶1、150∶1，將這5種碳磷比分別置于厭氧管中，溫度為3 0℃，調(diào)整pH為8，進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，48 h后用0.22 μm的微孔濾膜過濾得到上清液，測定TP含量，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在碳磷比不同的條件下，TP的去除率會隨著碳磷比的增加而逐漸增加，去除率最高時的碳磷比為150∶1，這時TP濃度為10.21，去除率為46.62%。

2.3.3 微量元素配比對細(xì)菌的生長和除磷性能的影響

指標(biāo)設(shè)為TP去除率和菌懸液的OD600，將3水平4因素數(shù)據(jù)填入表中，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。

圖4 碳氮比對除磷的影響

表6 微量元素的種類及濃度對磷酸鹽還原菌生長的影響

在表格中用A、B、C代表濃度水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和，R值為某一水平的最大與最小值的差值平均值，A、B、C能夠反應(yīng)出水平條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響程度，R值則表示在水平條件下某因素對實(shí)驗(yàn)的影響。如表6所示，由實(shí)驗(yàn)數(shù)值可以得出結(jié)論，對磷酸鹽還原菌的生長及除磷效率影響由大到小的順序依次為Mo、Ni、Co、Fe。最佳濃度配比：Mo為100 mg/L、Co為100 mg/L、Ni為20 mg/L、Fe為50 mg/L。

3 結(jié)束語

增加磷濃度能促進(jìn)磷酸鹽還原菌生長速率，增大除磷量，但是碳源能限制增加培養(yǎng)基中的總生物量。在以碳磷比為影響因素，以磷酸鹽還原菌的生長及除磷能力為研究對象時，結(jié)果顯示：當(dāng)不限制因素磷濃度時，培養(yǎng)基中的生物量和TP的去除率都會隨著碳濃度的提升而增加。探究四種微量元素Mo、Co、Ni、Fe的配比對磷酸鹽還原菌的生長和除磷能力的影響時，結(jié)果顯示 Mo 元素對磷酸鹽還原菌的影響效果最大，其次是 Co、Ni 和 Fe。其中最佳微量元素濃度為Mo為100 mg/L、Co為100 mg/L、Ni為20 mg/L、Fe為50 mg/L。

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Study on Characteristics of a Phosphate Reducing Strain

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(Shenyang Jianzhu University, Liaoning Shenyang 110168, China）

In an anaerobic-anoxic environment, an efficient phosphate reducing bacteria was screened out from the anaerobic tank of sewage treatment plant and was named as YING18.Physiological and biochemical studies and DNA sequence analysis of the strain were carried out.The dephosphorization effect of the strain and the factors affecting its characteristics were studied.The results showed that, phosphate concentration could affect the phosphate reduction ability of microorganisms.The growth rate of phosphate reducers accelerated and phosphorus removal rate increased with the increase of phosphorus concentration.The best ratio of carbon to phosphorus was 150∶1.The optimum ratio of the four trace elements was as follws: Mo=100 mg/L,Ni=20 mg/L,Co=100 mg/L,Fe=50 mg/L; and it was found that Mo had the largest effect on phosphate reducing bacteria,followed by Ni,Co and Fe.

phosphate reducing bacteria; phosphorus concentration; microelement

2019-11-14

譚舒波（1994-），女，遼寧省阜新市人，畢業(yè)于沈陽建筑大學(xué)環(huán)境工程專業(yè)，研究方向：污水處理。

X703.1

A

1004-0935（2020）03-0238-05