包曉瑋,李建瑛2,任 薇,魏晨業(yè),曾蘭君,張亞濤

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052;2.新疆軍區(qū)總醫(yī)院,新疆烏魯木齊 830052)

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)為胡頹子科灌木或小喬木,廣泛分布于歐亞的溫帶地區(qū)[1]。沙棘具有優(yōu)異的生態(tài)效益和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,耐寒、耐旱、耐鹽堿、耐脊薄,萌生繁殖能力強(qiáng),固氮能力強(qiáng)[2-3]。中國(guó)新疆地區(qū)由于其特殊的氣候環(huán)境和地貌特征,栽培了大面積的沙棘改善生態(tài)環(huán)境。沙棘為藥食兩用植物[4],果實(shí)成熟為橙黃色,果肉油潤(rùn)光滑。

沙棘果實(shí)含有豐富的生物活性物質(zhì),如礦物質(zhì)、維生素、碳水化合物、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、有機(jī)酸及揮發(fā)性物質(zhì)等[5-6],沙棘及提取物具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、降血脂和肝損傷的保護(hù)作用[7-10]。實(shí)驗(yàn)室前期從沙棘干果實(shí)中提取和純化得到沙棘多糖(PBP),發(fā)現(xiàn)PBP具有良好的體外抗氧化作用[11]。

多糖是自然界中廣泛存在的一類生物大分子,被認(rèn)為是繼核酸和蛋白質(zhì)之后的第三類生物信息大分子。有研究表明紅托竹蓀多糖使D-gal模型小鼠血清、肝腦組織中SOD、GSH-Px活性增加,MDA含量降低[12];淡竹葉多糖對(duì)D-gal模型小鼠的跳臺(tái)和Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)表明,可以使衰老小鼠的學(xué)習(xí)能提高[13];金釵石斛多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞損傷模型的抗衰老活性表明,金釵石斛多糖能夠提高損傷細(xì)胞存活率[14]。隨著年齡增長(zhǎng),身體抗氧化防御能力逐漸下降,這樣就會(huì)導(dǎo)致形成和清除活性氧ROS發(fā)生不平衡,進(jìn)而導(dǎo)致組織組織損傷引起的衰老[15]。為了避免細(xì)胞和組織損傷,機(jī)體有一套完整的防御系統(tǒng),能夠完全消除自由基和脂質(zhì)過氧化物,這套系統(tǒng)包括SOD及GSH-Px[16-17]。抗氧化劑常用作抗衰老劑,這是由于其有潛在的清除自由基的作用,然而,人工合成的氧化劑由于其在長(zhǎng)期使用中會(huì)產(chǎn)生副作用而受到限制[18],天然植物多糖作為生物活性物質(zhì)具有低毒性,因此,開發(fā)天然無毒的植物多糖作為抗氧化劑是非常重要和必需的,該研究結(jié)果為開發(fā)PBP作為天然的抗氧化劑并在抗衰老中的作用提供理論依據(jù)?；诙嗵堑目寡趸饔靡约癝OS、GSH-Px在抗衰老的作用,并結(jié)合前期開展的PBP體外抗氧化方面的研究基礎(chǔ),本研究用分離的PBP灌胃經(jīng)D-半乳糖皮下注射誘導(dǎo)的衰老模型小鼠,計(jì)算臟器指數(shù),并測(cè)定其肝臟、腦組織勻漿及血清中的SOD、GSH-Px活性和MDA含量,并結(jié)合肝臟和腦組織病理切片,評(píng)價(jià)PBP對(duì)衰老模型小鼠體內(nèi)抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

PBP 實(shí)驗(yàn)室制備提供[11];KM小鼠 雄性,五周齡,體重(20±2) g,購(gòu)于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(批號(hào):SCXK(新)2018003),清潔級(jí);D-半乳糖 上海國(guó)藥試劑集團(tuán);谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒 購(gòu)于南京建成生物工程研究所;其他試劑 均為分析純。

AL204-4C電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;TGL-21M高速冷凍離心機(jī) 上海盧湘儀科學(xué)儀器有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;BIO-RAD酶標(biāo)儀 美國(guó)BIO-RAD公司;AE-31數(shù)碼倒置顯微鏡 麥克奧迪公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 將適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后的60只健康的KM雄性小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(VE170 mg/kg)、PBP低劑量組(100 mg/kg)、PBP中劑量組(200 mg/kg)、PBP高劑量組(400 mg/kg),每天除空白組頸部皮下注射0.2 mL/10 g生理鹽水,其余各組均頸部皮下注射D-半乳糖溶液(120 mg/kg),然后空白組和模型組灌胃生理鹽水0.1 mL/10 g,陽(yáng)性組灌胃(VE170 mg/kg),其余各組按高、中、低連續(xù)灌胃PBP 30 d。灌胃期間每3 d稱量一次體重。

1.2.2 臟器指數(shù)測(cè)定 末次給藥禁食24 h后,眼球取血并分離血清。摘取肝臟及腦組織,用冷的生理鹽水洗凈各臟器組織,用吸水紙將水吸凈,并稱重各臟器組織重量,用于測(cè)定各臟器組織臟器指數(shù)。

臟器指數(shù)=臟器重量(g)/小鼠體重(g)

1.2.3 小鼠血清、肝組織及腦組織中SOD、GSH-Px活力及 MDA含量測(cè)定 利用冰浴過的生理鹽水制備10%的肝勻漿和腦勻漿2 mL,將制備后的勻漿于12000 r/min低溫離心10 min,將離心后的上清取出,按照試劑盒操作測(cè)定小鼠血清、肝臟組織和腦組織均漿液超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活力及丙二醛(MDA)含量。

1.2.4 病理切片制作 取各組動(dòng)物肝臟和腦組織用10%甲醛固定后,水洗、脫水和脫色;浸蠟和包埋;修塊、切片、貼片和展片;脫蠟、HE染色與鏡檢。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果及分析

2.1 體重及臟器指數(shù)測(cè)定

圖1 實(shí)驗(yàn)小鼠30 d內(nèi)體重變化Fig.1 Weight change in experimental mice within 30 d

由圖1看出,灌胃的30 d內(nèi)各組動(dòng)物體重均呈現(xiàn)出增長(zhǎng)趨勢(shì)。7 d后,模型組動(dòng)物體重總體低于其他各組,該趨勢(shì)一直持續(xù)到30 d;總體看來,在10～13 d期間,低劑量組動(dòng)物體重與模型組體重相近,其余各組高于模型組;在13 d后各組動(dòng)物體重均高于模型組;在19～30 d期間,中劑量組與VE組小鼠體重基本相近,高劑量組體重稍低于空白組,但高于其余各組。體重可以作為機(jī)體生理變化的一個(gè)指標(biāo),此體重的走勢(shì)可以說明,隨著衰老模型動(dòng)物造模天數(shù)的延長(zhǎng),動(dòng)物的體重也會(huì)隨著下降,可以表明隨著動(dòng)物的衰老其體重會(huì)下降,但通過給衰老模型小鼠灌胃PBP后具有緩解體重下降的作用。

表1 PBP對(duì)衰老小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of polysaccharide from Hippophae rhamnoides on organs indexes in aging mice

表2 PBP對(duì)小鼠肝、腦及血清中GSH-Px活性的影響Table 2 Effects of PBP on the activities of GSH-Px in liver,brain and serum of aging

由表1可知,模型組與空白組比較,除腎臟指數(shù)顯著下降(P<0.05)外,其余各臟器指數(shù)極顯著下降(P<0.01)。與模型組相比,PBP低劑量組腦指數(shù)顯著增加(P<0.05),對(duì)心臟、肝臟、脾臟及腎臟臟器指數(shù)無顯著影響(P>0.05);PBP中劑量組腦指數(shù)極顯著增加(P<0.01),心臟、脾臟指數(shù)顯著增加(P<0.05),對(duì)肝臟、腎臟指數(shù)無顯著影響(P>0.05);PBP高劑量組極顯著提高腦及心臟指數(shù)(P<0.01),顯著提高脾臟指數(shù)(P<0.05),對(duì)肝、腎臟指數(shù)增加不顯著(P>0.05)。臟器指數(shù)的變化可以反映出各器官的衰老情況,腦指數(shù)降低表明動(dòng)物神經(jīng)組織出現(xiàn)萎縮[19]。

心臟指數(shù)下降表明動(dòng)物心功能的下降,心臟及腦功能的下降,會(huì)誘發(fā)機(jī)體進(jìn)一步的衰老;肝臟和腎臟指數(shù)的降低表明動(dòng)物的代謝能力下降;脾臟指數(shù)下降表明小鼠免疫功能下降[20]。PBP灌胃給衰老小鼠后,中、高劑量組對(duì)衰老小鼠的腦、心臟及脾臟指數(shù)的降低有緩解作用,而且效果顯著,低劑量效果不顯著?？傮w評(píng)價(jià),PBP對(duì)于衰老引起的腦組織萎縮、心臟功能下降及免疫功能的下降有緩解作用且該作用具有劑量依賴性,但實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以表明,PBP對(duì)緩解衰老小鼠肝臟及腎臟指數(shù)的降低雖然沒有顯著作用,但是PBP高劑量可以表現(xiàn)出提高小鼠肝臟及腎臟指數(shù),該結(jié)果可能是因?yàn)镻BP對(duì)肝臟和腎臟指數(shù)的影響需要更高劑量才能表現(xiàn)出來。總體而言,PBP具有延緩衰老小鼠臟器退化的作用。

2.2 小鼠血清、肝組織及腦組織相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

2.2.1 GSH-Px活力測(cè)定 表2可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟、腦組織及血清中的GSH-Px活力均極顯著低于空白組(P<0.01),表明造模成功。與模型組相比,VE對(duì)照組肝勻漿中及血清中GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01),腦組織GSH-Px活性顯著增加(P<0.05);PBP低劑量組肝勻漿中GSH-Px活性極顯著增加(P<0.01),血清與腦勻漿GSH-Px活性增加不顯著(P>0.05);PBP中劑量組肝、腦勻漿及血清中的GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01);PBP高劑量組血清、肝和腦組織GSH-Px活性極顯著提高(P<0.01)。

GSH-Px通過特異性催化谷胱甘肽對(duì)過氧化氫的還原反應(yīng),發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞膜的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PBP作用于衰老模型動(dòng)物后,動(dòng)物血清、肝臟及腦組織中GSH-Px活性均提高,說明PBP能夠通過提高GSH-Px的活性來增強(qiáng)細(xì)胞穩(wěn)定性,進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體穩(wěn)定性延緩衰老。

2.2.2 SOD活力測(cè)定 由表3可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟及血清中的SOD活力均極顯著低于空白組(P<0.01),腦組織中SOD活力顯著降低(P<0.05),表明造模成功。與模型組相比,VE組肝臟中SOD活性顯著增加(P<0.05),血清及腦勻漿SOD活性活性極顯著增加(P<0.01);PBP低劑量組血清中SOD活性極顯著增加(P<0.01),肝臟及腦組織SOD活性增加不顯著(P>0.05);PBP中劑量組血清中SOD活性增加(P<0.01),腦組織SOD活性顯著增加(P<0.05),肝臟SOD活性增加不顯著(P>0.05);PBP高劑量肝臟、腦勻漿及血清中SOD活性均極顯著增加(P<0.01)。

抗氧化酶活性的作用的評(píng)價(jià)體系中,SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶,是生物體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)。在氧化應(yīng)激引發(fā)的衰老中,SOD的活性受到明顯的影響,大量研究表明,在衰老動(dòng)物模型、炎癥動(dòng)物模型、癌癥動(dòng)物模型等研究中,模型動(dòng)物血清和組織SOD含量明顯下降,說明SOD水平與機(jī)體衰老是正相關(guān)的[21-22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PBP高劑量作用于衰老模型動(dòng)物后,動(dòng)物血清、肝臟及腦組織中SOD活性均極顯著提高(P<0.01),表明PBP能夠改善衰老動(dòng)物機(jī)體抗氧化能力,進(jìn)而可以延緩衰老。

表3 PBP對(duì)小鼠肝、腦及血清中SOD活性的影響Table 3 Effects of PBP on the activities of SOD activity in liver,brain and serum of aging

表4 PBP對(duì)小鼠肝、腦及血清中MDA含量的影響Tasble 4 Effects of PBP on the contents of MDA in liver,brain and serum of aging

2.2.3 MDA含量測(cè)定 由表4可知,模型組與空白組相比,小鼠的肝臟、腦組織勻漿及血清中的MDA含量均極顯著增加(P<0.01),表明造模成功。與模型組相比,VE組肝臟、腦組織及血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01);PBP低劑量組肝、腦組織中MDA含量下降不顯著(P>0.05),血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01);PBP中劑量組肝勻漿和血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01),腦組織中MDA含量下降不顯著(P>0.05);PBP高劑量組肝臟、腦組織及血清中MDA含量極顯著下降(P<0.01)。

MDA是脂質(zhì)過氧化的重要產(chǎn)物之一,是衡量機(jī)體內(nèi)自由基代謝的特征指標(biāo),MDA的含量能夠客觀反映體內(nèi)自由基的水平,降低MDA含量是抗氧化研究中的一個(gè)重要機(jī)制[23]。許多研究表明,無論是D-半乳糖模型、輻照模型、臭氧損傷模型還是快速老化模型,都可以觀察到血清和組織細(xì)胞中MDA含量增加,隨著MDA的增多,會(huì)逐漸導(dǎo)致細(xì)胞和組織器官損傷,進(jìn)而會(huì)引起疾病[24-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,PBP作用于衰老模型動(dòng)物后,動(dòng)物血清、肝臟及腦組織中MDA含量均顯著降低(P<0.05),進(jìn)而表現(xiàn)出對(duì)衰老動(dòng)物的抗氧化作用。

2.3 PBP對(duì)衰老大鼠肝、腦組織形態(tài)的影響

由圖2可以看出,正常組中肝細(xì)胞以中央靜脈為中心樹狀有序排列,肝細(xì)胞膜完整,竇間隙明顯,胞體正常。模型組的肝細(xì)胞排列無序,肝臟的局部區(qū)域肝細(xì)胞明顯腫脹,肝細(xì)胞膜被破壞,結(jié)構(gòu)消失,細(xì)胞間組織相互融合,竇間隙消失。VE組的肝細(xì)胞排列有序,有個(gè)別細(xì)胞略微腫脹,竇間隙變窄,細(xì)胞變圓,包漿中有少量顆粒性物質(zhì)。PBP低劑量組的肝細(xì)胞腫脹明顯,細(xì)胞核大小不一(肝細(xì)胞代謝增強(qiáng)),竇間隙消失,細(xì)胞膜破碎,細(xì)胞間組織相互融合。PBP中劑量組的肝細(xì)胞腫脹,細(xì)胞核大小不一,竇間隙變窄,胞漿中可見少數(shù)空泡和顆粒性物質(zhì)。PBP高劑量組中肝細(xì)胞膜形態(tài)完整,竇間隙明顯,肝細(xì)胞排列有序。總體而言,衰老模型動(dòng)物肝細(xì)胞形態(tài)、排列及肝竇間隙均異常,PBP高劑量組能夠改善因衰老而導(dǎo)致的肝細(xì)胞異常,效果最明顯;PBP中劑量組也能改善因衰老導(dǎo)致的肝細(xì)胞異常,但效果不及高劑量組。

圖2 各組動(dòng)物肝組織切片 HE 染色結(jié)果(200×)Fig.2 The results of tissue slicing of liver sections by HE staining in each group(200×)注:A～F分別表示正常組、模型組、VE組、PBP低、中、高劑量組。

由圖3可以看出,正常組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整,膠質(zhì)細(xì)胞無集結(jié)現(xiàn)象。模型組中腦細(xì)胞呈網(wǎng)格狀大面積壞死,神經(jīng)細(xì)胞固縮,胞體體積變小,結(jié)構(gòu)不完整。VE組的神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)良好,膠質(zhì)細(xì)胞無集結(jié)現(xiàn)象。PBP低劑量組中膠質(zhì)細(xì)胞明顯增多,大量膠質(zhì)細(xì)胞聚集(腦組織壞死),神經(jīng)細(xì)胞壞死。PBP中劑量組膠質(zhì)細(xì)胞輕微聚集,神經(jīng)元細(xì)胞腫脹,邊緣尼氏小體溶解。PBP高劑量組的神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量明顯增多,細(xì)胞核居中,胞質(zhì)狀態(tài)良好,尼氏體正常。總體而言,衰老模型動(dòng)物表現(xiàn)腦細(xì)胞壞死,神經(jīng)細(xì)胞固縮,胞體體積變小,結(jié)構(gòu)不完整,PBP高劑量組能夠改善因衰老而導(dǎo)致的腦細(xì)胞異常,使細(xì)胞回復(fù)正常形態(tài),作用效果明顯;PBP中劑量組作用效果不及高劑量組。

圖3 各組動(dòng)物腦組織切片 HE 染色結(jié)果(200×)Fig.3 The results of tissue slicing of brain sections by HE staining in each group(200×)注:G～L分別表示正常組、模型組、VE組,PBP低、中、高劑量組。

3 討論與結(jié)論

小鼠體內(nèi)由于在D-半乳糖造成的亞急性中毒狀態(tài)下,體內(nèi)產(chǎn)生大量超氧陰離子自由基,對(duì)組織產(chǎn)生過氧化損害,這種生化和組織結(jié)構(gòu)的改變與自然衰老表現(xiàn)基本吻合[27],本實(shí)驗(yàn)通過建立D-gal致衰老模型評(píng)價(jià)PBP對(duì)衰老模型小鼠抗氧化作用。D-gal致衰老模型小鼠出現(xiàn)了模型組體重比正常組體重下降,心臟、腦組織、肝臟、脾臟及腎臟的臟器指數(shù)下降,模型組小鼠肝臟、腦組織及血清中的SOD、GSH-Px活性降低及MDA含量增加,這些指標(biāo)的變化說明了動(dòng)物表現(xiàn)出衰老。

通過灌喂PBP給D-半乳糖造成的衰老模型小鼠后,PBP(400 mg/kg)劑量可以緩解衰老模型小鼠的體重下降趨勢(shì),PBP(200、400 mg/kg)可提高衰老小鼠心臟、腦組織及脾臟臟器指數(shù),PBP(200、400 mg/kg)可提高衰老小鼠肝臟、腦組織及血清SOD和GSH-Px活性,降低肝臟、腦組織及血清的MDA含量,(400 mg/kg)使衰老小鼠的肝臟及腦組織的細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)可以得到正?；謴?fù)。這些結(jié)果表明PBP能夠有效地緩解和改善衰老,而且作用效果具有劑量依賴性,PBP可能是通過抗氧化作用延緩衰老作用的。