(溫州科技職業(yè)學院,浙江溫州 325006)

臺灣泥鰍(Paramisgumusdabryanusssp.)是臺灣地區(qū)選育的泥鰍新品種,肉鮮味美,富含優(yōu)質蛋白質、脂肪酸、多種礦物元素及B族維生素[1]。中醫(yī)認為,泥鰍具有補中氣、祛濕邪之用[2],被稱為“水中人參”,具有較高的藥用價值?，F(xiàn)有研究表明,從泥鰍中提取的蛋白、多糖、氨基酸等,具有提高機體免疫力、抗炎、抗氧化等作用[3-6]。

湯在中國人的飲食中居于十分重要的地位,古代哲人對湯膳的評價“寧可食無饌,不可飯無湯”就說明了湯膳的重要性[7]。湯的烹飪方式有利于營養(yǎng)物質的輸送,較大程度地保留食材風味的同時,可使食材中的營養(yǎng)物質最大程度地溶出促進消化,具有補充能量、滋補養(yǎng)生等功效[8]。不同的熬煮時間對湯的營養(yǎng)價值會有不同的影響,倪東東等[9]發(fā)現(xiàn),采用傳統(tǒng)常壓熬煮大鯢湯,熬煮60 min時湯中脂肪含量適宜,且飽和脂肪酸/多不飽和脂肪酸值(SFA/PUFA)最佳,氨基酸含量最高;朱琳等[10]研究發(fā)現(xiàn),當烏魚湯在熬制1.5 h后,營養(yǎng)物質的含量明顯提高,熬制魚湯的時間應控制在1.5～3 h。

泥鰍湯是一道歷史悠久的家常菜,其食療和藥用價值早已被報道[11],但大部分集中在臨床醫(yī)學研究上,而關于泥鰍湯的營養(yǎng)成分種類及其含量、泥鰍湯的抗氧化性研究鮮見報道。

本實驗以臺灣泥鰍為原料,通過分析泥鰍湯的可溶性蛋白、游離氨基酸、蛋白質組分變化及ABTS+·、DPPH·清除率,探究了泥鰍湯熬煮過程中營養(yǎng)品質的變化規(guī)律及抗氧化能力的變化,旨為科學合理地烹飪臺灣泥鰍湯提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活臺灣泥鰍 浙江平陽美飛淡水泥鰍養(yǎng)殖專業(yè)合作社;食鹽、姜等 永輝超市;乙腈 色譜純,北京壇墨質檢科技有限公司;正己烷 HPLC級,北京壇墨質檢科技有限公司;十七種氨基酸標準品 中國藥品生物制品檢定所;蛋白Marker 10～200 kDa,福州飛凈生物科技有限公司;牛血清白蛋白、乙醇、SDS、尿素、巰基乙醇等 均為國產分析純。

Agilent1100液相色譜儀 安捷倫科技(中國)有限公司;Agilent ZORBAX Eclipse AAA 安捷倫科技(中國)有限公司;伯樂Mini-PROTEAN Tetra cell165-8001電泳槽 美國Bio-Rad公司;721G紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;ALPHA2-4/LSC真空冷凍干燥機 德國Christ公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 臺灣泥鰍湯加工工藝 臺灣泥鰍→宰殺→放血→去黏液、內臟→清洗→分割、稱質量→加水→大火煮開→小火慢燉→臺灣泥鰍湯

1.2.2 不同熬煮時間對臺灣泥鰍湯品質的影響 分別以30、60、90、120、150 min為熬煮時間熬制泥鰍湯,取100 mL泥鰍湯樣品,于4 ℃、15000 r/min下離心10 min,取上清液進行蛋白組分(可溶性蛋白質、蛋白質電泳及游離氨基酸組成)分析和ABTS+·、DPPH·清除率的測定。

1.2.3 可溶性蛋白質含量的測定 采用雙縮脲法測定泥鰍湯中可溶性蛋白質含量[12]。準確移取上清液1 mL于試管中,加入4 mL雙縮脲試劑,充分振蕩均勻,置于室溫下反應30 min。然后,將試樣置于比色皿中用分光光度計在540 nm波長處測定吸光度。

1.2.4 游離氨基酸含量的測定 取上清液(1.2.2)2 mL于離心管中,加入2 mL 0.02 mol/L鹽酸,10000 r/min離心10 min,取上清液定容至10 mL用0.45 μm濾膜過濾,移取5 μL濾液采用安捷倫公司自動在線衍生化方法,一級氨基酸與鄰苯二甲醛、二級氨基酸與芴甲氧羰酰氯衍生后,采用高效液相色譜測定樣品[13]。色譜條件:色譜柱為ZORBAX Eclipse AAA(4.6×150 mm,3.5 μm);紫外檢測波長為338 nm,熒光檢測信號為(激發(fā)波長266 nm,發(fā)射波長305 nm);流動相A為40 mmol/L磷酸二氫鈉(pH7.8);流動相B為乙腈/甲醇/水=45/45/10;流速為1 mL/min;洗脫程序:0～31 min,0% B;31～33 min,54% B;33～41 min,100% B;41～43 min,0% B;流速為1 mL/min。取17種標準氨基酸混合樣品,每種最終濃度為0.25 μmol/mL,在同樣條件下進樣,將得到的每種氨基酸的峰面積對濃度作圖繪制17種氨基酸標準曲線,采用峰面積外標法進行定量。

1.2.5 SDS-PAGE蛋白電泳 取一定量的上清液(1.2.2)于真空冷凍干燥(絕對壓力85 Pa,升華溫度20 ℃)下干燥32 h,干燥所得樣品用蒸餾水稀釋10倍,添加等體積處理液(2% SDS、8 mol/L尿素、2%巰基乙醇)勻漿后100 ℃加熱5 min,室溫下在10000 r/min下離心15 min,上清液為上樣樣品。采用5%濃縮膠和12%分離膠,上樣量為10 μL。在穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀上進行電泳,調節(jié)電流,濃縮膠中為15 mA,分離膠為20 mA。當溴酚藍指示劑到達凝膠底部時停止電泳[14]。

1.2.6 抗氧化能力的測定

1.2.6.1 DPPH·清除率測定 參照文獻[15]中的方法并略做改進。取1 mL上清液(1.2.2)加1 mL濃度為0.2 mmol/L的DPPH,室溫下靜置30 min后,在517 nm波長處測吸光度變化。

DPPH·清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

式中:Ai為1 mL的DPPH+l mL樣品的吸光度;Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度;A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度。

1.2.6.2 ABTS+·清除率的測定 參照胥莉等[16]的方法并稍作修改。將7 mmol/L的ABTS溶液10 mL和7.35 mmol/L的K2S2O8溶液5 mL混合后,在室溫下避光放置12～16 h,形成ABTS儲備液,使用前用無水乙醇稀釋成ABTS工作液,使其在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.02。吸取50 μL上清液(1.2.2)與ABTS工作液3 mL混合均勻,室溫反應10 min后,于734 nm波長處測定其吸光度(A樣品),空白組以水代替樣品(A空白)。按下式計算ABTS+·清除率:

ABTS+·清除率(%)=(1-A樣品/A空白)×100

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel軟件進行初步分析,并用Origin 8.5軟件作圖,采用SPSS 22.0軟件進行相關處理和分析,其中,顯著性分析采用t-檢驗,P>0.05說明無顯著性差異,P<0.05說明差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同熬煮時間對泥鰍湯可溶性蛋白含量的影響

熬煮過程中部分可溶性蛋白質會溶于湯汁,且湯汁中的可溶性蛋白與肉湯的感官品質具有正相關關系[17]。圖1為不同熬煮時間對泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響。由圖1可知,在熬煮過程中,熬煮30～150 min,湯中可溶性蛋白質含量顯著(P<0.05)上升,在30～90 min期間上升速率較為相近,在90 min后上升速率有所提高,到150 min時可溶性蛋白質含量達到18.49 mg/mL。這與倪冬冬等[9]研究大鯢湯加工過程中蛋白質溶出趨勢一致。

圖1 不同熬煮時間對泥鰍湯的可溶性蛋白含量的影響Fig.1 Effect of different boiling time on soluble protein content of loach soup注:不同小寫表示差異顯著(P<0.05);圖3同。

2.2 不同熬煮時間對泥鰍湯蛋白組分的影響

不同熬煮時間泥鰍湯蛋白SDS-PAGE電泳圖如圖2所示。由圖2可知,隨著熬煮時間的延長,分子量>100 kDa蛋白條帶逐漸變淺,分子量為63～100 kDa的蛋白條帶逐漸增多和加深,說明大分子蛋白在熬煮過程中發(fā)生降解,隨著熬煮時間的延長,蛋白質降解程度不斷加深。在湯的熬煮過程中,肌肉纖維束開始破裂,肌肉纖維中的蛋白質在熱的作用下開始降解,水解成不同大小的短肽以及相應的游離氨基酸[18]。

表1 臺灣泥鰍湯的游離氨基酸含量Tabla 1 Free amino acids contents of in loach soup

圖2 不同熬煮時間泥鰍湯的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of loach soup with different boiling time

2.3 不同熬煮時間對泥鰍湯游離氨基酸含量的影響

湯中的游離氨基酸有助于形成肉湯的鮮美滋味,提高其營養(yǎng)價值[19]。由表1可得,泥鰍湯中共檢測到17種氨基酸,總游離氨基酸(TAA)含量隨熬煮時間呈現(xiàn)先上升后下降趨勢,在90 min時TAA達到最大值2957.20 μg/mL,隨后急劇下降。在90 min時泥鰍湯中半胱氨酸(22.5%)、甘氨酸(19.0%)、丙氨酸(11.6%)和谷氨酸(9.6%)含量較高,其次為組氨酸、賴氨酸、脯氨酸以及亮氨酸,絲氨酸含量最少。其中,谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸等氨基酸具有不同程度的甜味和鮮味,還有呈苦味的組氨酸等,這些豐富的氨基酸賦予了泥鰍湯醇厚而鮮美的滋味[13]。在90 min之后,泥鰍湯中TAA急劇下降,這可能是因為泥鰍湯在熬煮過程中,肌肉中蛋白質受熱降解成大小不同的小肽或者相應的游離氨基酸,通過物質交換溶出到湯汁中,當熬煮至一定時間,氨基酸會降解成肌苷酸和各類揮發(fā)性風味物質,這影響了氨基酸在泥鰍湯中的含量,同時肌肉中的纖維組織經過長時間熬煮會形成網狀結構吸附湯中的游離氨基酸[20-22]。動物肌肉細胞中含有多糖,在熱的作用下可水解生成單糖、雙糖和低聚糖[16],與湯中的游離氨基酸產生美拉德反應,這可能也是造成游離氨基酸含量降低的原因之一。

從必需氨基酸總量(EAA)分析比較,在90 min時泥鰍湯中必需氨基酸含有纈氨酸、蛋氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸,較其他組種類齊全且含量最高,為664.3 μg/mL。從鮮味氨基酸含量(UAA)分析比較,隨著熬煮時間的延長呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。在90 min時含量最高,達到1296.7 μg/mL,遠高于其他組;其中甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸是泥鰍湯中主要的鮮味氨基酸,略不同于倪冬冬等[9]測得大鯢湯中主要鮮味氨基酸(丙氨酸、精氨酸、谷氨酸)的種類。

綜上,在熬煮時間達到90 min時,泥鰍湯中游離氨基酸含量較高且必需氨基酸種類豐富,此時的鮮味氨基酸含量高,泥鰍湯醇厚鮮美。

2.4 不同熬煮時間對泥鰍湯抗氧化能力的影響

由圖3可知,隨著熬煮時間的增加,ABTS+·清除率逐漸上升,這可能是泥鰍在加熱過程中蛋白質降解產生多肽和游離氨基酸,極性基團數(shù)量增多,導致親水性增強,使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用,同時泥鰍多肽具有清除ABTS+·的能力[23]。在30～120 min時,ABTS+·清除率顯著(P<0.05)上升,從18.01%升至43.61%,熬煮到120 min時,ABTS+·清除率為43.29%,隨后略有下降。由于加熱烹飪會影響肉類蛋白質的結構,使粗肽中更多的疏水性基團位點暴露,導致疏水性提高,使其更容易與水溶性的ABTS+·發(fā)生作用[24]。因此，ABTS+·清除率升高。

圖3 不同熬煮時間對泥鰍湯ABTS+·和DPPH·清除率的影響Fig.3 Effect of different boiling time on ABTS+·and DPPH· scavenging rate of loach soup

泥鰍湯表現(xiàn)出較高的DPPH·清除能力,在熬煮時間30～90 min范圍內,清除率顯著(P<0.05)上升,從11.66%上升到84.10%,隨熬煮時間延長,泥鰍中的脂肪溶出,湯中脂肪含量增加,使其容易捕獲脂溶性的DPPH·,同時肌肉中多糖在熬煮過程中不斷的溶出,而泥鰍中的多糖又具有清除DPPH·的作用[25];在90～120 min時DPPH·清除率趨于平穩(wěn)(84.10%～87.25%),這可能是由于多糖降解的影響;在50 min時清除率上升至93.23%,DPPH·清除率升高是由于長時間的熬煮,某些游離氨基酸降解成一些殘基,比如親核側鏈的Cys殘基等,這些物質可以阻斷自由基的鏈式反應[24]。

3 結論

在泥鰍湯的熬煮過程中,熬煮時間對泥鰍湯的營養(yǎng)成分和抗氧化活性產生了很大的影響。隨熬煮時間的延長,湯中可溶性蛋白質含量顯著上升,在150 min達到18.49 mg/mL;SDS-PAGE蛋白電泳顯示,隨著熬煮時間的延長,大分子蛋白質發(fā)生降解產生多肽和氨基酸,在90 min湯中游離氨基酸含量最高達到2957.20 μg/mL,鮮味氨基酸含量高達到1296.70 μg/mL,湯汁口感鮮美。在抗氧化性方面,隨著熬煮時間的增加,湯中ABTS+·清除率和DPPH·的清除率整體呈上升趨勢。綜上,在烹飪臺灣泥鰍湯時,熬煮90 min較為合理,此時臺灣泥鰍湯的營養(yǎng)品質較好,且抗氧化能性強。