陳 花,王建軍2,向康樂,艾銀婷,王建武,王富剛

(1.榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,陜西榆林 719000;2.榆林學(xué)院能源工程學(xué)院,陜西榆林 719000)

海紅果(MalusmicromalusMakino)是薔薇科蘋果屬滇池海棠系的西府海棠種,是秦晉蒙交界地帶的特色果品,栽植歷史悠久,陜西府谷縣因其得天獨厚的生態(tài)環(huán)境非常適合海紅果的生長,因此被譽為“中國海紅果之鄉(xiāng)”,其果實營養(yǎng)豐富,被作為該地區(qū)極具產(chǎn)業(yè)開發(fā)的特色資源。但海紅果采后特別容易失水軟化,易受病原菌侵染導(dǎo)致腐爛,造成了極大的經(jīng)濟損失,因此海紅果采后保鮮對提高當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟效益至關(guān)重要。目前該地區(qū)主要的果蔬保鮮措施是低溫保藏,該法雖是一種非常有效的方法,但耗資高,增加了海紅果的銷售成本,進而影響銷量。

生物防治技術(shù)被認(rèn)為是果蔬采后病害防治的有效環(huán)保措施之一,而拮抗酵母以其來源廣泛、營養(yǎng)條件低、生長迅速、安全性高等特點,在水果采后病害防治方面被廣泛應(yīng)用,并且證明是一種行之有效的方法[1-2]。目前,人們對拮抗酵母的抑菌機理還沒研究清楚,但普遍認(rèn)為,應(yīng)用于保鮮劑的拮抗酵母絕大多數(shù)來源于一些果蔬表面,它們可以作為優(yōu)勢群體與病原菌在生長空間和營養(yǎng)方面競爭,進而達到抑菌的效果[3]。目前已知的具有防腐保鮮作用的拮抗酵母有羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii)[4-8]、黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis)[9-10]、膜醭畢赤酵母(Pichiamembranaefaciens)[11]、季也蒙畢赤酵母(Pichiaguilliermondii)[12-13]、Metschnikowiapulcherrima[14]等。雖然拮抗酵母在果蔬保鮮方面表現(xiàn)突出,但在復(fù)雜的環(huán)境條件下,單獨使用拮抗酵母其效果還無法與化學(xué)殺菌劑相比,因此研究拮抗酵母復(fù)合保鮮技術(shù)成為拮抗酵母應(yīng)用的必經(jīng)之路[15-18]。

熱處理作為一種安全無毒的物理方法可以殺死已經(jīng)潛伏于果蔬上的病原微生物,但對于熱處理之后侵染果實的病原菌作用甚微,也就是采后熱處理不能防止果蔬的二次污染,難以對果蔬進行有效保護;而拮抗酵母作為果蔬表面的優(yōu)勢菌可防止其在貯藏過程中被病原菌侵染。本研究擬將拮抗酵母處理和熱處理相結(jié)合,發(fā)揮二者各自優(yōu)勢,彌補不足,探索一種可以逐步替代化學(xué)殺菌劑的安全高效保鮮技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮海紅果(M.micromalusMak) 采自府谷縣麻鎮(zhèn)海紅果種植基地,清晨采摘,采后立即人工挑選成熟度一致、大小和顏色均一、無病蟲害和機械損傷的果實作為供試材料,將其用泡沫盒(35 cm×25 cm×16 cm,壁厚2 cm)加冰袋的方式運回實驗室;拮抗酵母為羅倫隱球酵母(Cryptococcuslaurentii) 購自北鈉創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司(BNCC),將酵母菌接種到5°Bé麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基上在25～28 ℃下進行活化培養(yǎng)3 d,用接種環(huán)刮取菌落置于無菌水中,調(diào)整濃度為107CFU/mL;磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;甲硫氨酸、氮藍四唑、核黃素、過氧化氫、乙二胺四乙酸二鈉、石英砂、愈創(chuàng)木酚 上海藍劑科技發(fā)展有限公司;三氯乙酸、硫代巴比妥酸、鉬酸銨、草酸、濃硫酸、偏磷酸、氫氧化鈉、酚酞、95%乙醇、去離子水、草酸、氫氧化鋇、堿石灰、鄰苯二酚、液氮、焦碚酚 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

HSX-160恒溫恒濕培養(yǎng)箱 常州邁科諾儀器有限公司;UV-1780分光光度計 島津儀器(蘇州)有限公司;D-37520高速冷凍離心機 賽默飛世爾科技有限公司;SKY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器 上海蘇坤實業(yè)有限公司;BCD-221MLA冰箱 合肥美菱股份有限公司;HH·S21-6S水浴鍋 上海躍進醫(yī)療器械有限公司;M200移液槍 大龍醫(yī)療設(shè)備(上海)有限公司;MLS-3781L高壓蒸汽滅菌鍋 日本松下醫(yī)療器械株會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組及樣品處理 參照趙妍[19]的方法,實驗分為5組,海紅果果實不經(jīng)過清洗,每組30個果實。對照組(CK):果實不經(jīng)過任何處理作為對照組;H組:果實經(jīng)過36 ℃熱空氣處理10 h;C組:果實經(jīng)107CFU/mL羅倫隱球酵母懸浮液浸泡2 min后室溫下自然晾干;H+C組:果實先經(jīng)36 ℃熱空氣處理10 h,然后經(jīng)107CFU/mL羅倫隱球酵母懸浮液浸泡2 min后室溫下自然晾干;C+H組:果實先經(jīng)107CFU/mL羅倫隱球酵母懸浮液浸泡2 min后室溫下自然晾干,再經(jīng)36 ℃處理10 h;每個處理組3次重復(fù)。處理完成后將果實置于塑料保鮮盒(175 mm×135 mm×60 mm)中,放入20 ℃、濕度為85%的培養(yǎng)箱恒溫恒濕儲藏15 d,貯藏期每3 d測量果實各項指標(biāo)。

1.2.2 指標(biāo)測定

1.2.2.1 果實失重率測定 采用稱重法測定[20]。

失重率(%)=[果實原有質(zhì)量(g)-測量時質(zhì)量(g)]×100/果實原有質(zhì)量(g)

1.2.2.2 果實腐爛率測定

腐爛率(%)=腐爛個數(shù)×100/總個數(shù)

1.2.2.3 活性氧代謝酶類的測定 海紅果去皮,用剪刀剪取0.5 g海紅果樣品,加入0.5 g石英砂放入研缽中,量取8 mL磷酸鹽緩沖液,在冰浴中研磨成溶液,將勻漿置于離心管中,于2 ℃冷凍離心機15000 r/min冷凍離心30 min,上清液即為酶提取液冷藏保存。

超氧化物歧化酶(SOD)采用NBT光還原法[20]。過氧化氫酶(CAT)活性測定采用紫外吸收法[20]。過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[20]。

1.2.2.4 丙二醛(MDA)含量的測定 采用硫代巴比妥酸法測定[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計并制圖,數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示;采用SPSS 22.0軟件對相同儲藏條件下不同處理組的各項指標(biāo)進行方差分析和鄧肯氏多重比較,在P=0.05的水平下檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果果實失重率的影響

果實采摘后由于呼吸作用消耗有機物和水分,必將導(dǎo)致果實的重量減少,失重率增大,故失重率是反應(yīng)果實采后保鮮的重要指標(biāo)。

圖1表示不同處理對采后海紅果果實失重率的影響,拮抗酵母處理組果實失重率幾乎在15 d內(nèi)均顯著(P<0.05)低于CK組。大量試驗結(jié)果也表明果實經(jīng)拮抗酵母處理后可以降低其貯藏期的失重率。秦曉杰等[21]研究發(fā)現(xiàn),采后草莓經(jīng)拮抗酵母處理后明顯減小了果實的失重率;溫新宇[22]研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了酵母 Y35-1 液體劑型和活性凍干粉劑對降低貯藏中的枇杷果失重率起到了積極的作用,與本實驗結(jié)果一致。結(jié)合處理組的果實失重率在整個貯藏期間均顯著(P<0.05)低于單獨處理組和CK,至貯藏第15 d時,結(jié)合處理組果實顏色多數(shù)亮紅,而其他處理組果實多數(shù)暗紅并出現(xiàn)了明顯地軟化,可能的原因是熱處理和拮抗酵母聯(lián)合處理較單獨處理組能有效降低有害菌的定植和繁殖,從而減少了此類菌代謝過程中對果實有機質(zhì)的損耗。先熱空氣后拮抗酵母處理組的海紅果在貯藏過程中其失重率始終處于最低水平,且后期(第12 d開始)顯著(P<0.05)低于先熱空氣后拮抗酵母處理組,表明熱空氣、拮抗酵母單獨處理和二者結(jié)合處理均可以降低海紅果的失重率,但作用效果有差異,先熱空氣處理后拮抗處理海紅果,其后期保鮮效果最佳,能有效降低海紅果內(nèi)水分和有機物的流失。

圖1 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果果實失重率的影響Fig.1 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on weight loss rate of postharvest circassian fruit注:H:單獨熱處理組;C:單獨拮抗酵母處理組;H+C:先熱空氣后拮抗酵母處理組;C+H:先拮抗酵母后熱空氣處理組;同一時間段,不同小寫字母表示差異顯著,P<0.05;圖2～圖6同。

2.2 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果果實腐爛率的影響

腐爛率是判斷水果貯藏保鮮效果最直觀的感官性狀,海紅果采后貯藏過程中易被霉菌污染而導(dǎo)致腐爛變質(zhì),這直接影響海紅果商品的貨架期。

由圖2可知,海紅果果實腐爛率隨貯藏時間延長逐步上升,對照組的果實腐爛在貯藏第3 d便開始出現(xiàn),具體表現(xiàn)為果實的外表面有褐色斑點出現(xiàn),并有少量的灰褐色菌絲附著其上,處理組的果實腐爛率均在貯藏第6 d開始出現(xiàn)。貯藏至15 d時,對照組腐爛率達到了36.77%,此時的果實表面附著了大量的灰色霉層,霉味極濃,各處理組此時的腐爛率均小于15%,保鮮盒內(nèi)霉味不明顯。差異性顯著分析表明,處理組的果實腐爛率在整個貯藏期顯著(P<0.05)低于對照組;結(jié)合處理組的海紅果腐爛率在貯藏第12 d差異不顯著(P>0.05)外,其余時間內(nèi),海紅果先經(jīng)熱空氣后經(jīng)拮抗酵母處理,其腐爛率均顯著(P<0.05)低于其他處理組。結(jié)合處理的先后順序?qū)ψ匀粻顟B(tài)下病原菌的生防效果有顯著性的影響,先熱空氣處理后拮抗酵母處理能明顯地抑制病原微生物的生長,原因是熱處理后,果實表面已潛伏的病原微生物得到了控制,后經(jīng)拮抗酵母處理能有效地抑制病原微生物在果實表面的生長繁殖,從而起到了持久的防腐效果。而若果實先經(jīng)拮抗酵母處理,后又經(jīng)熱空氣處理,熱空氣不僅抑制了病原微生物的生長也會導(dǎo)致定植在果實表面的部分酵母菌喪失活力,因此效果不如先空氣處理后拮抗酵母處理組。這與韋瑩瑩[20]的研究結(jié)果一致。

圖2 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果果實腐爛率的影響Fig.2 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on decay rate of postharvest circassian fruit

2.3 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果抗氧化酶活性的影響

植物受到病原菌侵?jǐn)_時,會啟動一系列的防御反應(yīng),增強自身抗病能力,從而保護組織免受病原侵害[14]。果蔬在正常生長的情況下,外界的誘導(dǎo)因子也可以激活自身的抗病體系,防止被病原菌侵染[19],在早期的防御反應(yīng)中會出現(xiàn)活性氧(ROS)爆發(fā),產(chǎn)生大量的超氧陰離子、過氧化氫和羥基自由基等活性氧反應(yīng)的中間物質(zhì)。過多的ROS能加速細胞的脂質(zhì)過氧化反應(yīng),進而導(dǎo)致植物組織衰老甚至死亡,植物組織為了阻止這一過程的發(fā)生,存在著一套完整的ROS清除體系,主要是一些抗氧化酶包括POD、SOD、CAT、APX和GPX共同協(xié)調(diào)植物體內(nèi)活性氧的代謝平衡,對誘導(dǎo)果蔬的抗性起到了重要作用。

圖3為不同處理對采后海紅果超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響,開始儲藏時,各組果實SOD活性之間差異不顯著(P>0.05)。隨時間的延長,各組SOD活性均呈先快速下降后緩慢上升的趨勢,且酶活性均在第6 d達到最低。可能的原因是貯藏初期,果實脫離了母體養(yǎng)分供給,表現(xiàn)為SOD活性迅速下降是一個適應(yīng)突變環(huán)境的自我保護反應(yīng)[23],后期SOD活性緩慢上升,原因是果實的衰老積累了大量的ROS誘導(dǎo)果實的SOD活性增加。各處理組相比較,貯藏第3 d開始,先熱空氣后拮抗酵母處理組SOD活性始終處于最高水平,顯著高于其他處理組(P<0.05)。相比單一防治方法,兩種防治方法結(jié)合處理表現(xiàn)了一定的協(xié)同效應(yīng),能進一步提高SOD活性,且先熱空氣后拮抗酵母處理組效果最好。

圖3 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果SOD(U·g-1·FW-1)活性的影響Fig.3 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on SOD activity of postharvest circassian fruit

2.3.2 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對采后海紅果果實過氧化物氫酶(CAT)活性影響 在維持細胞活性氧代謝平衡過程中,CAT能將O2-經(jīng)SOD催化作用產(chǎn)生的H2O2進一步分解為H2O和O2,減少H2O2對果實組織細胞的傷害。

圖4表示不同處理對采后海紅果過氧化物氫酶(CAT)活性的影響,各組果實CAT活性變化和SOD活性變化趨于一致。貯藏前9 d果實CAT活性下降,之后雖有平穩(wěn)回升,但貯藏結(jié)束時CAT活性仍低于貯藏時的CAT活性,且在貯藏第9 d時活性降到了最低。CAT活性在貯藏初期下降的原因仍是一個適應(yīng)外部環(huán)境,重新調(diào)整代謝的一個過程,后期有所回升的原因是受到由于細胞代謝活力下降而導(dǎo)致體內(nèi)累積的H2O2刺激誘導(dǎo)產(chǎn)生了較多CAT,但此時細胞活力較貯藏開始時差,所以即使CAT活性有所提高但仍不及貯藏開始時活力強。與CK相比,整個貯藏期,海紅果經(jīng)單獨熱處理、單獨拮抗酵母處理和二者結(jié)合處理均顯著地(P<0.05)提高CAT活性,且先熱空氣處理后拮抗酵母處理組POD活性從貯藏第3 d開始一直處于最高水平,分別比CK提高了62.16%、76.61%、112.92%、114.21%、73.99%;先拮抗酵母后熱空氣處理組僅次其后,分別比CK提高了55.28%、72.23%、100.18%、105.76%、71.90%。各處理組相比較,結(jié)合處理組的CAT活性在這個貯藏期均顯著(P<0.05)高于單獨處理組。拮抗酵母和熱空氣的結(jié)合應(yīng)用協(xié)同性地誘導(dǎo)了CAT活性的積累,效果優(yōu)于單獨處理組。

圖4 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對海紅果CAT活性的影響Fig.4 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on CAT activity of postharvest circassian fruit

2.3.3 拮抗酵母結(jié)合熱空氣對采后海紅果果實過氧化物酶(POD)活性的影響 POD的功能與CAT一樣,能夠清除H2O2,是細胞的活性氧調(diào)節(jié)劑,還可以催化酚類物質(zhì)氧化成木質(zhì)素,增強植物的抗性。

圖5表示不同處理對采后海紅果過氧化物酶(POD)活性的影響,各組果實POD活性在整個貯藏過程中變化不大。整個貯藏過程中,POD活性處于較高水平的處理組為拮抗酵母單獨處理組和結(jié)合處理組,且先熱空氣后拮抗酵母處理組POD活性始終處于最高水平,但三組的差異性不顯著(P>0.05);POD活性處于較低水平的處理組是CK和熱空氣單獨處理組,此兩組酶活性除貯藏的第6 d外,其他時間差異不顯著(P>0.05)。在貯藏后期(第9 d開始),較高水平的三個處理組均顯著(P<0.05)高于較低水平的兩個處理組,在貯藏的15 d時,拮抗酵母單獨處理組、先拮抗酵母處理后熱空氣處理組和先熱空氣處理后拮抗酵母處理組POD活性較CK分別提高了41.56%、57.36%和65.18%;可見,拮抗酵母和熱空氣結(jié)合處理海紅果,能提高其POD活性,較單獨拮抗酵母處理組差異不顯著(P>0.05),能顯著(P<0.05)高于CK和熱空氣處理組,分析其原因可能是拮抗酵母處理能顯著提高POD酶活性,但POD活性較熱源敏感,熱空氣作用可能抑制了POD活性,因此二者結(jié)合處理雖表現(xiàn)一定的促進效應(yīng),但效果并未優(yōu)于單獨拮抗菌處理效果。

圖5 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對海紅果POD活性的影響Fig.5 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on POD activity of postharvest circassian fruit

整個貯藏過程中結(jié)合處理組果實的三種酶活性均高于其他處理組,其中先熱空氣后拮抗酵母處理組的活性氧代謝酶活性始終處于最高水平,其次是先拮抗酵母后熱空氣處理組,其SOD活性從貯藏的第3 d開始均顯著低于先熱空氣后拮抗酵母處理組(P<0.05)外,POD和CAT活性雖低于先拮抗酵母處理后熱空氣處理組,但差異不顯著(P>0.05);表明拮抗酵母和熱空氣聯(lián)合處理的順序不同,對海紅果貯藏期細胞的抗氧化系統(tǒng)影響不大,但結(jié)合處理效果優(yōu)于單獨處理組。大量研究結(jié)果也表明,拮抗酵母復(fù)合技術(shù)在果實的生防和保鮮方面優(yōu)于拮抗酵母單獨處理。Guo等[24]研究表明茉莉酸甲酯結(jié)合拮抗酵母C.laurentii處理對誘導(dǎo)提高柑橘POD和CAT活性,優(yōu)于單獨施用的茉莉酸甲酯或拮抗酵母,與本試驗研究結(jié)果相似。

2.4 拮抗酵母結(jié)合熱空氣對采后海紅果果實丙二醛(MDA)含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生進一步加劇了膜的損傷,促進了細胞的衰老。

圖6表示不同處理對采后海紅果丙二醛(MDA)含量的影響,各組果實丙二醛含量在貯藏期內(nèi)呈上升趨勢,均在15 d達到了最大值;在貯藏前3 d內(nèi),MDA含量差異不顯著(P>0.05);從第6 d開始,各處理組均顯著低于CK(P<0.05),結(jié)合處理組均顯著(P<0.05)低于單一處理組;整個貯藏期,先熱空氣后拮抗酵母處理組MDA含量始終處于最低水平,先拮抗酵母后熱空氣處理組MDA含量次之,但二者差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明,拮抗酵母和熱空氣結(jié)合處理海紅果能減輕MDA含量的積累,此方面優(yōu)于單獨處理組。羅凱[25]研究拮抗酵母菌Hanseniasporauvarum分別結(jié)合化學(xué)物質(zhì)CaCl2、NaHCO3和水楊酸對提高草莓果實采后貯藏性能的研究結(jié)果表明,其二者結(jié)合使用明顯提高草莓的抗性相關(guān)酶活性,減緩了丙二醛(MDA)含量的積累,這與本研究結(jié)果相一致。

圖6 拮抗酵母結(jié)合熱空氣處理對海紅果MDA含量的影響Fig.6 Effect of antagonistic yeast combined with hot air treatment on MDA content of postharvest circassian fruit

3 結(jié)論

大量研究結(jié)果表明拮抗酵母復(fù)合技術(shù)在果實的生防和保鮮方面優(yōu)于拮抗酵母單獨處理。本研究結(jié)果也證實了107CFU/mL羅倫隱球酵母結(jié)合36 ℃熱空氣處理確能有效降低果實的失重率和腐爛率,提高果實的病害生防效果,也能有效提高活性氧代謝酶的活性進而清除細胞內(nèi)代謝產(chǎn)生的ROS,減輕膜脂過氧化反應(yīng),進而降低丙二醛含量來延緩細胞衰老,達到了保鮮的目的,其保鮮效果優(yōu)于單獨處理組;尤其是在整個貯藏過程中,先熱空氣后拮抗酵母處理組的海紅果果實所測指標(biāo)幾乎均處于最優(yōu)水平。因此,先36 ℃熱空氣處理10 h后107CFU/mL羅倫隱球酵母懸浮液浸泡處理2 min是采后海紅果果實保鮮處理的適宜方式。本實驗研究了拮抗酵母復(fù)合技術(shù)對海紅果采后生理生化指標(biāo)的影響,對該復(fù)合技術(shù)的作用機制并未深入研究,這將作為今后研究的重點。