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(1.廣西科技大學(xué)生物與化學(xué)工程學(xué)院,廣西柳州 545006;2.廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院,廣西柳州 545005)

多酚類化合物普遍存在于植物界,是植物中豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1-2],具有很高的抗氧化能力[3]。有研究表明,多酚類化合物還有許多生物特性,如抗炎、抗過(guò)敏、抗菌、保護(hù)心臟等[4-6]。由于多酚化合物具有較高的利用價(jià)值,應(yīng)用廣泛,因此,各類植物、食品中多酚化合物的分離、檢測(cè)及其質(zhì)量控制等方面引起了眾多研究者的關(guān)注[7-9]。

甘蔗廣泛分布于溫帶和熱帶地區(qū),其含糖量高,主要用作生產(chǎn)糖和酒精[10]。甘蔗在加工過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物如甘蔗渣。研究表明,甘蔗是多酚含量較高的植物,在蔗葉、蔗梢、蔗莖中均含有大量的高分子多酚類化合物,其多酚含量均在為500 mg/kg以上[11-14]。多酚類化合物可與多酚氧化酶作用引起酶促褐變反應(yīng),使蔗糖顏色加深[15-16]。為了提高對(duì)甘蔗渣的充分利用率,并對(duì)蔗糖進(jìn)行質(zhì)量控制,因此有必要對(duì)多酚類化合物的提取、分離及檢測(cè)進(jìn)行進(jìn)一步研究。

甘蔗中可檢測(cè)多酚類化合物含量較低,干擾成分較多且基底復(fù)雜,目前,對(duì)于甘蔗中多酚分離檢測(cè)的研究相對(duì)較少,且不充分。目前常用的多酚的分析方法為高效液相色譜法[17-18]和毛細(xì)管電泳法[19],但高效液相色譜法多采用梯度洗脫且分析時(shí)間較長(zhǎng),毛細(xì)管電泳法分析快速卻常出現(xiàn)干柱和氣泡問(wèn)題,影響柱效。加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是 21 世紀(jì)初發(fā)展起來(lái)的一種新型分離技術(shù),將液相色譜與毛細(xì)管電泳結(jié)合,實(shí)現(xiàn)以壓力流和電滲流作為雙重驅(qū)動(dòng)力,解決了高效液相色譜法分析時(shí)間長(zhǎng)和毛細(xì)管電泳法的干柱和氣泡問(wèn)題,達(dá)到更加快速、高效的分離檢測(cè)目的[20-21]。目前加壓毛細(xì)管電色譜在藥品、食品、環(huán)境安全等方面已得到廣泛應(yīng)用[22-24]。本文利用加壓毛細(xì)管電色譜,對(duì)影響分離檢測(cè)的色譜條件流動(dòng)相比例、緩沖鹽種類、濃度及pH、離子對(duì)試劑濃度、分離電壓、流速等進(jìn)行優(yōu)化,建立了分離檢測(cè)甘蔗中綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甘蔗 廣西柳州;綠原酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;甲醇 色譜純,德國(guó)Merck 公司;庚烷磺酸鈉 色譜純,天津市化學(xué)試劑研究所;磷酸二氫鈉、乙酸鈉、乙酸銨、氫氧化鈉、鹽酸、乙酸乙酯 分析純,廣東汕頭市西隴化工廠;實(shí)驗(yàn)用水 均為超純水。

TriSepTM-2100 加壓毛細(xì)管電色譜 上海通微分析技術(shù)有限公司;UV-2102PC型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司;RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取綠原酸、阿魏酸、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品各25 mg,分別置于25 mL棕色容量瓶,用甲醇溶解并定容,配制成1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。用甲醇按梯度將其分別稀釋為20、40、80、160、320 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均在4 ℃下避光保存。

1.2.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精密吸取1 mg/mL的綠原酸、阿魏酸、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液各80 μL,用甲醇稀釋至1 mL,作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液備用。

1.2.3 多酚的提取 參考Fang等[25]的提取方法,將所購(gòu)甘蔗去皮后榨去蔗汁,取甘蔗渣適量干燥后,研磨成粉。準(zhǔn)確稱取甘蔗渣粉末10.00 g,加入1 mol/L NaOH溶液150 mL,室溫下磁力攪拌6 h后,用6 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH至2.0,移至分液漏斗中,用乙酸乙酯萃取三次,將萃取液放至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干,得到紅棕色膏狀物(為萃取后除脂及多糖之后,富含多酚類化合物的混合物),放至冰箱4 ℃保存。取適量上述棕紅色膏狀物,用甲醇溶解,通過(guò)0.20 μm的針式微孔濾膜過(guò)濾,冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 pCEC色譜條件 色譜柱:毛細(xì)管填充柱(EP-100-20/45-3-C18,內(nèi)徑100 μm,總長(zhǎng)度45 cm,有效長(zhǎng)度20cm,填料為內(nèi)徑3 μm OSD);流動(dòng)相:15.0 mmol/L NaH2PO4+12.5 mmol/L庚烷磺酸鈉(pH5.0)/甲醇(50∶50,V/V);流動(dòng)相總流速:0.06 mL/min;分離電壓:1 kV;檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm;分流閥壓力調(diào)至10.5 MPa。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)(上海通微公司)采集數(shù)據(jù),Microsoft Excel 2010和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pCEC色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 用紫外分光光度計(jì)在200～400 nm范圍內(nèi)分別對(duì)濃度均為80 μg/mL的綠原酸、阿魏酸、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行掃描,結(jié)果如圖1所示,三種多酚在220 nm處都有較強(qiáng)的紫外吸收,因此選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 紫外吸收色譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption chromatogram注:1:綠原酸;2:阿魏酸;3:表兒茶素;圖2～圖9同。

2.1.2 有機(jī)相比例的優(yōu)化 有機(jī)相在流動(dòng)相中所占比例會(huì)影響樣品在固定相和流動(dòng)相之間的分配比例,進(jìn)一步改變分離選擇性。實(shí)驗(yàn)考察了甲醇比例分別為60%、55%、50%、45%及40%對(duì)綠原酸、阿魏酸、表兒茶素分離的影響。取“1.2.2”所配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.2.4”所述 pCEC色譜條件進(jìn)行分離檢測(cè)(圖2～圖8均在此條件下檢測(cè))。如圖2所示,隨著甲醇比例為逐步降低,三種多酚類化合物的出峰時(shí)間逐步增加,60%甲醇時(shí),綠原酸和阿魏酸分離度較低且表兒茶素峰型較差;55%甲醇時(shí),表兒茶素峰形拖尾;50%甲醇時(shí),三種多酚可得到較好的基線分離,保留時(shí)間較短,峰形較好,理論塔板數(shù)較高;隨著甲醇比例的進(jìn)一步降低,即甲醇比例為45%和40%時(shí),三種多酚類化合物保留時(shí)間較長(zhǎng),不利于快速分離檢測(cè)。因此,實(shí)驗(yàn)選擇50%甲醇作為最優(yōu)有機(jī)相比例。

圖2 不同甲醇比例電色譜圖Fig.2 pCEC electropherograms at different methanol ratios

2.1.3 緩沖溶液種類的優(yōu)化 pCEC分離系統(tǒng)中,為了形成穩(wěn)定的電場(chǎng)和電滲流,需要在流動(dòng)相中加入可以導(dǎo)電的酸堿或者緩沖鹽溶液。實(shí)驗(yàn)分別考察了濃度均為15 mmol/L的CH3COONa、CH3COONH4、NaH2PO4緩沖溶液對(duì)上述三種多酚類化合物的分離影響。如圖3所示,當(dāng)流動(dòng)相中加入CH3COONa緩沖溶液時(shí),表兒茶素峰形前沿,峰寬較寬;流動(dòng)相中加入CH3COONH4緩沖溶液時(shí),綠原酸、阿魏酸、表兒茶素均峰形拖尾或前沿,柱效較低;而采用NaH2PO4緩沖溶液時(shí),三種多酚類化合物的峰形得到明顯改善,減輕或消除了拖尾或前沿現(xiàn)象,峰形較為對(duì)稱,柱效較高。因此,實(shí)驗(yàn)選擇NaH2PO4作為流動(dòng)相中添加的緩沖鹽。

圖3 不同緩沖鹽電色譜圖Fig.3 pCEC electropherograms at different buffer salt

2.1.4 緩沖溶液濃度的優(yōu)化 緩沖鹽溶液濃度決定了Zeta電位、雙電層厚度和毛細(xì)管內(nèi)壁表面電荷超量等,對(duì)樣品的分離、樣品峰柱效等有著明顯的影響,因此,實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察了NaH2PO4緩沖溶液濃度分別為10.0、12.5、15.0、17.5、20.0 mmol/L時(shí)對(duì)綠原酸、阿魏酸、表兒茶素分離的影響。結(jié)果如圖4所示。隨著NaH2PO4緩沖溶液濃度的增加,三種多酚峰形改善、柱效升高,但當(dāng)NaH2PO4濃度過(guò)高時(shí),電流值增大,產(chǎn)生較高的焦耳熱,反而造成峰形拖尾,柱效下降。綜合考慮,實(shí)驗(yàn)選擇15.0 mmol/L NaH2PO4作為最優(yōu)緩沖鹽濃度。

圖4 不同濃度NaH2PO4電色譜圖Fig.4 pCEC electropherograms of NaH2PO4 at different concentrations

2.1.5 離子對(duì)試劑濃度的優(yōu)化 由于綠原酸、阿魏酸、表兒茶素以及甘蔗中干擾成分結(jié)構(gòu)相似,含有較多酚羥基,且甘蔗中干擾成分眾多,均導(dǎo)致了待測(cè)樣品分離難度。而離子對(duì)試劑可通過(guò)與帶電荷分析物結(jié)合,形成配對(duì)離子,從而選擇性增加帶電荷分析物的保留時(shí)間,因此在緩沖鹽溶液中加入一定濃度的離子對(duì)試劑,可改善三種多酚之間以及多酚與甘蔗中其它干擾成分的分離。實(shí)驗(yàn)采用庚烷磺酸鈉作為離子對(duì)試劑,并考察了當(dāng)庚烷磺酸鈉濃度分別為5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 mmol/L時(shí)的三種多酚的分離情況。如圖5所示，隨著庚烷磺酸鈉濃度的升高,三種多酚的分離度越來(lái)越好,保留時(shí)間逐步縮短,當(dāng)庚烷磺酸鈉濃度為15.0 mmol/L時(shí),阿魏酸、表兒茶素峰出現(xiàn)拖尾和前沿,分離度下降。綜合分離度和保留時(shí)間,選擇12.5 mmol/L庚烷磺酸鈉作為最優(yōu)離子對(duì)試劑濃度。

圖5 不同濃度離子電色譜圖Fig.5 pCEC electropherograms of ion pair reagent at different concentration

2.1.6 流動(dòng)相pH的優(yōu)化 綠原酸、阿魏酸、表兒茶素都含有酚羥基,容易在溶液中電離,呈現(xiàn)出一定酸性。pH可通過(guò)改變?nèi)N多酚類化合物的電離情況,從而通過(guò)改變其電色譜行為,改變其分離情況。實(shí)驗(yàn)考察了不同pH的NaH2PO4緩沖溶液對(duì)三種多酚的分離情況。如圖6所示，緩沖鹽溶液pH分別為3.5、4.0、4.5時(shí),隨著pH的增大,三種多酚的保留時(shí)間逐步減小,三種多酚的分析周期仍較長(zhǎng),不利于其快速分離測(cè)定;pH5.0時(shí),三種多酚保留時(shí)間進(jìn)一步減小,但峰形和分離度很好;pH5.5時(shí),由于產(chǎn)生過(guò)大的電滲流,分析周期最短,但表兒茶素峰型也受到影響。因此,選擇pH5.0作為流動(dòng)相的最優(yōu)pH。

圖6 不同pH下電色譜圖Fig.6 pCEC electropherograms at different pH

2.1.7 分離電壓的優(yōu)化 隨著施加電壓的增大,會(huì)產(chǎn)生大量的焦耳熱,從而影響電滲流的大小,進(jìn)一步影響柱效。實(shí)驗(yàn)考察了分別在-3、-1、0、1、3 kV電壓下三種多酚的分離效果,結(jié)果如圖7所示。當(dāng)施加負(fù)壓時(shí),三種多酚保留時(shí)間較短,當(dāng)施加電壓為-3 kV時(shí),綠原酸與阿魏酸峰重疊。當(dāng)施加電壓為-1 kV時(shí),阿魏酸與表兒茶素峰無(wú)法完全分離;當(dāng)施加正壓時(shí),三種多酚保留時(shí)間延長(zhǎng),但分離度較負(fù)壓好。當(dāng)施加電壓為1 kV時(shí),三種多酚的分離度高且峰型較好;當(dāng)施加電壓為3 kV時(shí),阿魏酸峰型較差,柱效下降,且保留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。因此,選擇1 kV作為最優(yōu)分離電壓。

表1 綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限Table 1 Linear range,regression equation,correlation coefficient(r)and LODs of chlorogenic acid,ferulic acid and epicatechin

圖7 不同分離電壓下電色譜圖Fig.7 pCEC electropherograms at different voltages

2.1.8 流動(dòng)相流速的優(yōu)化 流速的大小直接影響了柱壓,從而影響各組分保留時(shí)間的長(zhǎng)短以及分離情況,實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相流速分別為0.05、0.06、0.07 mL/min時(shí)綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的分離情況。如圖8所示,隨著流動(dòng)相流速的增大,三種多酚的保留時(shí)間縮短,分析時(shí)間減少,分離度下降。當(dāng)流動(dòng)相處于較低流速時(shí),三組分峰形展寬,柱效下降;當(dāng)流動(dòng)相處于較高流速時(shí),柱壓上升,表兒茶素峰型變差;在流速為0.06 mL/min時(shí),三組分之間分離度好且仍能達(dá)到基線分離。因此,實(shí)驗(yàn)選擇0.06 mL/min為最佳流動(dòng)相流速。

圖8 不同流速下電色譜圖Fig.8 pCEC electropherograms at different flow rates

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 線性范圍和檢出限 取“1.2.1”所配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照“1.2.4”所述色譜條件進(jìn)行分析,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。如表1所示,綠原酸、阿魏酸、表兒茶素在20～320 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)在0.9922～0.9978之間,檢出限(LODs,S/N=3)分別為0.14、0.75、1.65 μg/mL。

2.2.2 精密度 分別取80 μg/mL的綠原酸、阿魏酸、表兒茶素標(biāo)準(zhǔn)溶液,連續(xù)進(jìn)樣五次,結(jié)果顯示,綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值分別為2.82%、2.69%、1.18%,表明儀器精密度良好。

2.2.3 樣品分析 將提取的樣品溶液,按照“1.2.4”所述 pCEC色譜條件進(jìn)行分離檢測(cè),結(jié)果如圖9。計(jì)算測(cè)得甘蔗渣中綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的含量分別為135.68、99.66、21.98 μg/mL。

圖9 三種多酚混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及甘蔗樣品電色譜圖Fig.9 pCEC electropherograms of three polyphenol mixed standard solutions and sugarcane samples注:a:混合標(biāo)準(zhǔn)溶液;b:樣品。

2.2.4 回收率 對(duì)樣品中的綠原酸、阿魏酸、表兒茶素進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定,結(jié)果如表2所示,綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的回收率均良好,在96.79%～100.71%之間,RSD為2.24%～3.09%,表明該方法具有較好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性,適合甘蔗中多酚類化合物的分離檢測(cè)。

表2 甘蔗中綠原酸、阿魏酸、表兒茶素加標(biāo)回收率(n=3)Table 2 Recovery of chlorogenic acid,ferulic acid and epicatechin in sugarcane(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了加壓毛細(xì)管電色譜分離甘蔗中綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的方法,優(yōu)化了流動(dòng)相比例、pH、緩沖鹽濃度、分離電壓、流速等色譜條件。在流動(dòng)相為15.0 mmol/L NaH2PO4+12.5 mmol/L庚烷磺酸鈉(pH5.0)/甲醇(50∶50,V/V);分離電壓為1 kV;流動(dòng)相總流速為0.06 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm的色譜條件下,綠原酸、阿魏酸、表兒茶素在線性范圍為20～320 μg/mL的檢出限分別為0.14、0.75、1.65 μg/mL,加標(biāo)回收率為96.79%～100.71%,RSD為2.24%～3.09%。該方法快速、高效,可用于甘蔗中綠原酸、阿魏酸、表兒茶素的分離檢測(cè)。