樊艷葉,3,林日輝,*,楊 慧,周麗紅4,曾藝君4,黃霞潔,蔣心濛

(1.廣西民族大學化學化工學院,生物轉(zhuǎn)化與過程反應重點實驗室,廣西南寧 530008;2.廣西民族大學化學化工學院,廣西多糖材料與改性重點實驗室,廣西南寧 530008;3.非糧生物質(zhì)酶解國家重點實驗室,廣西南寧 530000;4.廣西民族大學相思湖學院,廣西南寧 530008)

木薯淀粉作為一種可再生的碳水化合物,在食品、藥品、化妝品及燃料生產(chǎn)方面具有非常廣闊的工業(yè)應用前景[1],但由于其本身存在冷水可溶性差、抗剪切能力差以及易老化等諸多不足,使得木薯淀粉的應用受到限制[2]。因此,迫切需要對木薯淀粉進行改性研究,使其具有獨特的理化性能,以滿足不同工業(yè)應用的需求。在目前眾多的淀粉改性方法中,堿/醇法作為化學改性中的一種方法[3],由于其具有操作簡單以及易于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)勢,一直受到廣大研究者的關注[4]。如范聰聰?shù)萚5]研究了乙醇/堿法對顆粒狀冷水可溶性蕎麥淀粉溶解度的影響,發(fā)現(xiàn)溫度對淀粉溶解度的影響最大,其次是堿的用量,并且獲得最優(yōu)條件下淀粉的最大溶解度為22.52%。Choi等[3]報道了乙醇和堿處理對馬鈴薯淀粉理化性能產(chǎn)生顯著影響。本課題組前期在研究堿/乙醇處理對木薯淀粉去結晶化的影響中,獲得了具有可控去結晶化的淀粉顆粒,并發(fā)現(xiàn)氫氧化鈉濃度對淀粉可控去結晶化的影響最顯著[6]。由此可見,堿/乙醇處理可顯著影響淀粉的結構與性能。然而,目前對于利用堿/醇法對淀粉進行的改性研究,主要集中在利用氫氧化鈉對淀粉進行處理,并且針對堿成分中OH-對淀粉分子內(nèi)氫鍵影響來分析其對淀粉的作用機制[7-8],不同堿處理的差異及堿成分中金屬離子對淀粉分子結構的影響迄今未見報道。

因此,本文將第IA主族堿金屬氫氧化物溶解于90%乙醇中,配成不同類型的堿/醇溶液,對木薯淀粉進行處理,并通過偏振光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、掃描電子顯微鏡、X-射線衍射分析、傅里葉變換紅外光譜儀以及直鏈淀粉含量、還原糖含量分析等手段,系統(tǒng)研究不同堿對木薯淀粉顆粒形貌、結晶性質(zhì)以及分子結構等的影響,為后續(xù)進一步探索新的淀粉改性方法及優(yōu)化淀粉改性的工藝技術等研究提供思路和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

木薯淀粉 食品級,廣西岑溪市三角淀粉有限責任公司;氫氧化鋰、氫氧化銫(一水合物) 分析純,上海麥克林生化科技有限公司;氫氧化鈉、碘 分析純,成都金山化學試劑有限公司;氫氧化鉀、3,5-二硝基水楊酸(DNS)、結晶酚 分析純,國藥集團化學試劑有限公司;氫氧化銣 分析純,阿法埃莎(中國)化學有限公司;無水乙醇、溴化鉀 分析純,成都市科隆化學品有限公司;直鏈淀粉標準品、支鏈淀粉標準品 美國Sigma-Aldrich公司;二甲基亞砜(DMSO) 分析純,天津市大茂化學試劑廠;碘化鉀、酒石酸鉀鈉(四水)、無水亞硫酸鈉、氰基硼氫化鈉 分析純,阿拉丁試劑(上海)有限公司;葡萄糖 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;濃鹽酸 分析純,廉江市愛廉化試劑有限公司;8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(APTS) 熒光級,阿拉丁試劑(上海)有限公司。

AL104型電子分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司;30 mL平蓋式反應釜 西安儀創(chuàng)實驗室儀器設備有限公司;WGLL-65BE型電熱鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司;SUPRA 55 Sapphire型場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司;MiniFlex600型X射線衍射儀 日本理學公司;ML32型生物顯微鏡 廣州市明美光電技術有限公司;MAGNA-1R550型傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技公司;85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 上海皓莊儀器有限公司;UV2300II型紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;Leica TCS SP8型激光共聚焦顯微鏡 德國徠卡微系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 堿/醇溶液處理木薯淀粉 準確稱取1 g木薯淀粉置于反應釜中,加入15 mL濃度為0.2 mol/L堿溶液(氫氧化鋰、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化銣以及氫氧化銫)，其中溶液采用90%乙醇溶液配制,于120 ℃電熱鼓風干燥箱中反應4 h。待反應結束后,冷卻至室溫,真空抽濾取濾餅,用95%乙醇洗滌三次,置于電熱鼓風干燥箱中(35±1) ℃,過夜烘干得處理淀粉樣品供后續(xù)分析,每個反應條件設置3個平行。

1.2.2 掃描電子顯微鏡分析 用導電膠將處理前后的木薯淀粉樣品固定到金屬樣品臺上,在真空狀態(tài)下噴鉑20 min后,在2.00 kV的加速電壓下放大2000倍觀察樣品的顆粒形貌[9]。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡分析 參照張奎亮等的方法[10],取10 mg處理前后的木薯淀粉樣品，分別與新鮮配制的15 μL 10 mmol/L 8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽(8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid trisodium salt,APTS)醋酸溶液及15 μL 1 mol/L氰基硼氫化鈉混合,于30 ℃反應15 h,用1 mL去離子水清洗5次,將淀粉顆粒懸浮于100 μL 50%甘油與水的混合液中,取一滴懸浮液進行激光共聚焦顯微觀察并拍照。所用熒光激發(fā)波長為488 nm。

1.2.4 偏振光顯微鏡分析 將處理前后的木薯淀粉樣品均勻分散到無水乙醇中,取一滴分散液于載玻片上,蓋上蓋玻片,調(diào)節(jié)顯微鏡至偏振光狀態(tài),在400×的放大倍數(shù)下觀察樣品的雙折射現(xiàn)象并拍照[11]。

1.2.5 X-射線衍射分析 實驗條件:Cu(ka)射線,Ni片濾波,電壓40 kV,電流15 mA,掃描范圍2θ為4～60 °,掃描速率為8 °/min,掃描步長為0.02 °。并利用MDI Jade 6.0軟件參照Shu等[12]的方法計算淀粉樣品的相對結晶度。

1.2.6 紅外光譜分析 利用溴化鉀壓片法將處理前后的木薯淀粉樣品分別與溴化鉀研磨壓片,然后在掃描分辨率為4 cm-1、掃描次數(shù)為32次以及掃描波數(shù)范圍為400～4000 cm-1的測試條件下進行紅外光譜測定[13]。

1.2.7 直鏈淀粉含量測定 參照黃祖強的方法[14]對處理前后木薯淀粉中直鏈淀粉的含量進行測定。分別配制濃度為0.0235 mg/mL的直鏈和支鏈淀粉標準溶液,移取直鏈淀粉標準溶液0、1、3、5、7、9、10 mL到7支試管中,再分別移取相應體積的支鏈淀粉標準溶液到上述試管中,配制成總體積為10 mL的直/支鏈淀粉標準混合液,各加入20 μL 2%的碘液,混勻,用紫外可見分光光度計測定混合溶液在600 nm處的吸光度。以混合溶液中直鏈淀粉的質(zhì)量X(mg)為橫坐標,吸光度Y為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:

Y=2.4851X+0.0469(R2=0.9995)

式(1)

圖1 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的掃描電鏡圖(2000×)Fig.1 SEM images of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(2000×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氫氧化鋰醇溶液處理淀粉,c. 氫氧化鈉醇溶液處理淀粉,d. 氫氧化鉀醇溶液處理淀粉,e. 氫氧化銣醇溶液處理淀粉,f. 氫氧化銫醇溶液處理淀粉。

稱取200.0 mg的淀粉樣品,加入少量的90%二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO),加熱攪拌溶解后定容至50 mL。移取2 mL溶液,用去離子水定容至250 mL,混勻后按照標準曲線的方法測定樣品溶液吸光度。按式(1)計算直鏈淀粉的質(zhì)量X,然后按式(2)計算樣品中的直鏈淀粉含量(%):

式(2)

式中:m為淀粉樣品的質(zhì)量,mg。

1.2.8 還原糖的測定 參照《生物化學實驗》中總糖與還原糖的測定(3,5-二硝基水楊酸法)方法對處理樣品的沉淀與上清液中的還原糖進行測定[15],并略作修改。配制濃度為500 μg/mL的葡萄糖標準溶液,取6支試管,分別加入0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL葡萄糖標準溶液,再分別加入相應體積的蒸餾水到上述試管中至溶液總體積為0.5 mL,各加入0.5 mL的3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid,DNS)試劑,加熱冷卻后各加入4 mL蒸餾水,搖勻,用紫外可見分光光度計測定混合溶液在540 nm處的吸光度。以葡萄糖含量X(μg)為橫坐標,吸光度Y為縱坐標,繪制標準曲線,得回歸方程:

Y=0.0033X-0.0334(R2=0.9948)

式(3)

分別稱取原木薯淀粉以及處理樣品沉淀各1 g,加入約30 mL蒸餾水后在磁力攪拌器上加熱攪拌溶解,用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH至中性,冷卻后定容至50 mL容量瓶中,過濾;另分別取處理樣品上清液15 mL,用0.5 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)其pH至中性。然后分別取樣品沉淀濾液及上清液各2.5 mL,各加入2.5 mL DNS試劑混勻,沸水浴加熱5 min后冷卻至室溫,直接測定樣品液在540 nm處的吸光度。按式(3)分別計算樣品中的沉淀液和上清液中的還原糖質(zhì)量X1(μg)和X2(μg),然后按式(4)計算樣品中總還原糖含量(%):

式(4)

式中:m為淀粉樣品的質(zhì)量,g。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復3次,并采用 Origin 9.0 以及Excel 2010統(tǒng)計軟件對相應的實驗數(shù)據(jù)進行處理,并利用SPSS 24軟件對數(shù)據(jù)進行鄧肯式顯著性差異分析。所有數(shù)據(jù)均表示為:平均值±標準偏差。

2 結果與分析

2.1 堿/醇處理對木薯淀粉顆粒形貌的影響

不同堿/醇溶液處理前后對木薯淀粉顆粒形貌影響的電鏡分析結果如圖1所示?？梢?原木薯淀粉是具有截頭末端且表面光滑的圓形,這與Campanha等[16]和Sangseethong等[17]觀察到的結果類似;經(jīng)過不同的堿/醇溶液處理后,所有木薯淀粉仍保持顆粒的完整性,形貌也未發(fā)生顯著變化。說明在90%乙醇中,0.2 mol/L的堿處理不足以破壞淀粉的顆粒形貌,這與Zhu等[18]報道的高濃度乙醇可有效抑制淀粉的過度膨脹相類似。因為根據(jù)秦海麗等[8]的報道,在堿/醇溶液處理淀粉過程中,堿/醇的作用是相互制衡的。堿的作用趨向于促進淀粉分子羥基上的質(zhì)子發(fā)生解離,使得淀粉分子帶負電,使之相互排斥,從而促進顆粒溶脹,隨著堿濃度的增大,作用力增強,最終導致淀粉結晶結構被打破,結晶序列發(fā)生變化。但淀粉顆粒周圍存在的乙醇,可以抑制淀粉顆粒的吸水溶脹,維持顆粒的結構與形貌[8]。

2.2 堿/醇處理對木薯淀粉激光共聚焦顯微的影響

圖2 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的激光共聚焦顯微鏡圖(630×)Fig.2 CLSM of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(630×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氫氧化鋰醇溶液處理淀粉,c. 氫氧化鈉醇溶液處理淀粉,d. 氫氧化鉀醇溶液處理淀粉,e. 氫氧化銣醇溶液處理淀粉,f. 氫氧化銫醇溶液處理淀粉。

圖3 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的偏振光顯微鏡圖(400×)Fig.3 Polarized light micrographs of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions(400×)注:a. 原木薯淀粉,b. 氫氧化鋰醇溶液處理淀粉,c. 氫氧化鈉醇溶液處理淀粉,d. 氫氧化鉀醇溶液處理淀粉,e. 氫氧化銣醇溶液處理淀粉,f. 氫氧化銫醇溶液處理淀粉。

木薯淀粉經(jīng)不同堿/醇溶液處理前后的激光共聚焦顯微結果如圖2所示。由圖2可知,原木薯淀粉的內(nèi)部有一個黑點,即為淀粉的臍點,而在臍點處可觀察到有空腔,空腔四周有輕微的裂縫,這與Huber等[19]對玉米和高粱淀粉的觀察結果相似。此外,有少量淀粉顆粒還可觀察到明暗相間的環(huán)層結構,根據(jù)陳佩等[20]的報道,此結構即為淀粉顆粒中由結晶層與無定形層交替形成的生長環(huán)。經(jīng)過堿/醇溶液處理后,淀粉顆粒內(nèi)部空腔處的裂縫均有不同程度擴大。陳佩[21]在利用酸處理淀粉時也發(fā)現(xiàn),淀粉顆粒內(nèi)部裂縫變寬且數(shù)量增多現(xiàn)象,其原因是酸滲透到淀粉的內(nèi)部,并于臍點周圍由內(nèi)向外破壞淀粉的結構?？梢?堿/醇液也可以滲透到木薯淀粉的內(nèi)部,產(chǎn)生類似酸處理的結果。結合掃描電鏡的觀察結果可知,堿/醇溶液處理對木薯淀粉的去結晶化作用主要始于顆粒內(nèi)部,而非顆粒表面。此外,不同堿金屬氫氧化物對木薯淀粉顆粒內(nèi)部裂縫的影響表現(xiàn)出從氫氧化鋰到氫氧化銫(a～f)逐漸增大的趨勢。其中氫氧化銫處理的樣品的裂縫變化最大,裂縫變寬且數(shù)量增多,有些裂縫甚至穿過整個淀粉顆粒。而氫氧化鋰和氫氧化鈉處理樣品裂縫的變化則相對較少,且大部分裂縫的長度相對較短。

2.3 堿/醇處理對木薯淀粉雙折射現(xiàn)象的影響

木薯淀粉經(jīng)不同堿/醇溶液處理前后的雙折射現(xiàn)象如圖3所示。由圖3可知,原木薯淀粉具有明顯的偏光十字,而經(jīng)過不同堿/醇溶液處理后,樣品的偏光十字并沒有消失,且并未發(fā)現(xiàn)不同堿/醇溶液處理樣品間的偏光十字有明顯差異。根據(jù)莫芳等[2]的報道,在偏振光下可觀察到淀粉的雙折射現(xiàn)象,是因為淀粉顆粒內(nèi)部分子鏈有序排列的結晶區(qū)和無序排列的無定形區(qū)在密度和折射率上存在差異。而結合激光共聚焦顯微鏡觀察結果,可推測在實驗條件下,不同堿/醇液處理雖然對淀粉顆粒內(nèi)部產(chǎn)生影響,但這種影響尚不足以完全消除淀粉內(nèi)部的結晶區(qū)與無定形區(qū)間的差異,因此淀粉的雙折射現(xiàn)象仍得以維持。

2.4 堿/醇處理對木薯淀粉結晶結構的影響

木薯淀粉經(jīng)不同堿/醇溶液處理前后的X射線衍射如圖4所示。原淀粉在2θ為15、17、18以及23°附近有明顯的衍射尖峰,其晶型屬于A型[22-23]。經(jīng)過氫氧化鉀、氫氧化銣、氫氧化銫醇溶液處理的樣品,在2θ為18 °附近的衍射峰消失,說明這三組處理在一定程度上改變了淀粉的晶型;而氫氧化鋰和氫氧化鈉醇溶液處理的樣品衍射峰位置與原淀粉相比無顯著變化,晶型維持為A型。從衍射峰強度分析,淀粉經(jīng)不同堿/醇溶液處理后,衍射強度均比原淀粉有不同程度降低。其中,氫氧化銫處理的樣品,其衍射峰均變?yōu)檩^為平緩的饅頭峰,衍射強度最低;其余處理樣品衍射峰強度由弱至強順序分別為由氫氧化銣、氫氧化鉀、氫氧化鈉及氫氧化鋰醇溶液。這可能是因為不同堿金屬離子與淀粉分子鏈上的基團產(chǎn)生不同強度的靜電作用,從而改變淀粉分子鏈原有的有序排列。可見,在氫氧根濃度一致的基礎上,由第IA主族不同堿金屬氫氧化物組成的堿/醇溶液對木薯淀粉進行去結晶化處理,樣品的晶型、相對結晶度(表1)均有顯著(P<0.05)區(qū)別。這表明堿金屬離子在淀粉去結晶化過程中參與了影響淀粉結構變化的相關反應,為此,實驗采用紅外光譜分析方法,以進一步了解堿/醇溶液對木薯淀粉進行去結晶化處理過程中是否產(chǎn)生新的共價鍵或基團。

圖4 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的X射線衍射圖Fig.4 X-ray diffraction patterns of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

表1 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的相對結晶度Table 1 Relative crystallinity of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

2.5 堿/醇處理對木薯淀粉紅外光譜的影響

圖5為經(jīng)不同堿/醇溶液處理前后木薯淀粉的紅外光譜。由圖5可知,原木薯淀粉在3412、2932、1650、1459、1422、1373、1340、1157、1084、994、926 cm-1的峰分別歸屬于-OH的伸縮振動、-CH2-的不對稱伸縮振動、無定形區(qū)H2O的彎曲振動、-CH2-的彎曲振動、-CH2-的彎曲振動以及C-O-O的伸縮振動、-CH-的彎曲振動、-CH2-的彎曲振動、C-O和C-C的伸縮振動、結晶區(qū)的特征峰、無定形區(qū)的C-O、α-1,4糖苷鍵的骨架模式振動(C-O-C),這與Kumar等[24]對淀粉的紅外峰進行的歸屬相類似。處理后的木薯淀粉與原淀粉相比,既沒有生成新的吸收峰,也沒有特征峰的消失,說明不同堿并不與淀粉分子形成新的官能團。但是,不同堿處理的木薯淀粉在3412 cm-1處的峰向高波數(shù)方向偏移,并且其強度均有所降低,說明不同堿處理使淀粉分子鏈中的氫鍵減少。推測其可能是堿金屬離子與淀粉分子鏈中的基團產(chǎn)生靜電作用,從而影響淀粉分子鏈間的有序排列,進而導致分子鏈中的氫鍵作用減弱。

圖5 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的紅外光譜圖Fig.5 FTIR spectra of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions注:a. 原木薯淀粉,b. 氫氧化鋰醇溶液處理淀粉,c. 氫氧化鈉醇溶液處理淀粉,d. 氫氧化鉀醇溶液處理淀粉,e. 氫氧化銣醇溶液處理淀粉,f. 氫氧化銫醇溶液處理淀粉。

2.6 堿/醇處理對木薯淀粉中直鏈淀粉及還原糖含量的影響

木薯淀粉經(jīng)不同堿/醇溶液處理前后的直鏈淀粉含量如圖6所示。由圖6可知,不同堿對木薯淀粉中的直鏈淀粉含量有明顯的影響,而且隨著堿相應金屬元素所在周期的增大,直鏈淀粉含量顯著下降(P<0.05),這與Raja[25]報道的堿處理使木薯淀粉的直鏈淀粉含量下降的結果相似。根據(jù)Kim等[26]的報道,直鏈淀粉含量實際上主要由直鏈淀粉和支鏈淀粉的部分長鏈(B鏈)兩部分組成。Uthumporn等[27]和Othman等[28]的研究表明淀粉中直鏈淀粉含量下降主要是因為直鏈淀粉發(fā)生降解,而根據(jù)樣品中總還原糖含量測定的結果可知(圖7),所有處理樣品中的總還原糖含量均高于原木薯淀粉。根據(jù)以上結果可推測堿/醇處理可使木薯淀粉中的直鏈淀粉發(fā)生降解,從而導致總還原糖含量升高。然而對于處理樣品中總還原糖含量由高到低的順序表現(xiàn)為氫氧化鉀>氫氧化銣>氫氧化鋰>氫氧化鈉>氫氧化銫的原因目前尚未清楚,有待進一步研究。

圖6 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉的直鏈淀粉含量圖Fig.6 Amylose contents of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions 注:圖中不同小寫字母表示樣品間直鏈淀粉含量在P<0.05水平上差異顯著,圖7同。

圖7 不同堿/醇溶液處理的木薯淀粉還原糖含量圖Fig.7 Concentration of reducing sugar of cassava starch treated with different alkali/alcohol solutions

3 結論

本文利用第IA主族不同堿金屬氫氧化物的醇溶液處理木薯淀粉,得出以下結論:不同堿對木薯淀粉顆粒外部的影響相對較小,其主要作用發(fā)生在顆粒內(nèi)部。不同堿處理并未使淀粉分子形成新的官能團,而是影響淀粉內(nèi)的分子鏈排列,從而導致其晶型以及相對結晶度發(fā)生明顯變化(P<0.05),且造成直鏈淀粉含量由22.30%降低至16.51%。不同堿對木薯淀粉結構的影響呈現(xiàn)出隨著堿中的堿金屬離子所在相應元素周期的增大而增強的規(guī)律性,即氫氧化鋰與氫氧化鈉對淀粉的影響相對較弱,而氫氧化鉀和氫氧化銣的作用居中,作用最強的是氫氧化銫。