許騰,劉歡,高耀,令狐婷,高曉霞,周玉枝,田俊生,秦雪梅*

(1.山西大學 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,山西 太原 030006;2.地產(chǎn)中藥功效物質研究與利用山西省重點實驗室,山西 太原 030006;3.中國輻射防護研究院 藥物安全評價研究中心,山西 太原 030006)

0 引言

抑郁癥是以顯著且持久的情緒低落為基本臨床特征,呈無趣、無欲、無助、無望、無快感的狀態(tài),嚴重者甚至自殺,是目前最常見的精神障礙之一,也是致殘的主要原因之一,嚴重影響患者的生活、工作和學習[1-4]。

目前臨床上治療抑郁癥多以選擇性5-HT及去甲腎上腺素(NE)再攝取抑制劑(SNPIs)(文拉法辛)為主,克服了第一代抗抑郁劑MAOI(單胺氧化酶抑制劑)和TCAs(三環(huán)類)的心臟毒性和抗膽堿能毒性,但是該類藥物整體有效率不超過 70%,起效時間需 2～4 周[5],且存在胃腸功能紊亂、認知功能減退、性欲降低等不良反應[6]。而中藥復方在抑郁癥治療中具有多成分、多靶點、多效應、毒副作用小、協(xié)同作用強和整體調節(jié)的獨特優(yōu)勢[7],目前已上市的具有抗抑郁作用的中藥復方主要有逍遙丸、解郁丸、解郁安神顆粒、烏靈膠囊、安樂膠囊和柴胡舒肝丸等。

本課題組經(jīng)過前期對逍遙散的最佳抗抑郁組分進行藥效學篩選和抗抑郁物質基礎的研究,在逍遙散組方的基礎上去掉生姜和茯苓得到復方柴歸方,并對其提取工藝進行優(yōu)化[8-12]。本文在前期對FFCGF進行單次給藥毒性預實驗和最大耐受量實驗的基礎上篩選其抗抑郁有效劑量、驗證FFCGF抗抑郁藥效,并確定其最佳劑量,為確定臨床劑量提供基礎依據(jù)。

1 材料

1.1 主要實驗儀器

主要儀器:透明圓筒玻璃缸(高30 cm,直徑15 cm);小鼠懸尾實驗箱;自制大鼠曠場測試箱(長100 cm、寬100 cm、高80 cm)底部平均分為25格[13]等。

1.2 藥品與試劑

復方柴歸方(柴胡20 g、當歸20 g、白芍20 g、麩炒白術20 g、炙甘草10 g、薄荷6.7 g,以上藥材均購于山西省華陽藥業(yè)有限公司)。經(jīng)本課題組前期提取工藝研究和藥效學篩選,最終確定以乙醇提取合并藥渣水提醇沉部分的工藝來制備FFCGF[14]。鹽酸文拉法辛膠裹(博樂欣,25 mg/粒,成都康弘藥業(yè)集團股份有限公司,批號140805)。逍遙丸(濃縮)(200丸/瓶,九芝堂股份有限公司,批號201412074);苦味酸酒精溶液、蒸餾水、蔗糖、水合氯醛等。

1.3 實驗動物

實驗動物:SPF級ICR雄性小鼠,雄性,體重18～22 g;SPF級SD雄性大鼠體重180～220 g,均購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2014-0001。自然晝夜節(jié)律(12 h白天,12 h黑夜),室溫20～25℃,濕度40%～60%,自由飲食飲水(自來水、普通飼料),適應1周。

2 方法

2.1 抗抑郁有效劑量篩選實驗

2.1.1 實驗分組及給藥

根據(jù)本課題組前期單次給藥毒性實驗、最大耐受量實驗結果來設劑量篩選實驗。適應期結束后,根據(jù)小鼠體重隨機分為:空白對照組、陽性對照組(鹽酸文拉法辛膠囊0.05 g/kg)、劑量1組(FFCGF 28 g生藥/kg)、劑量2組(FFCGF 14 g生藥/kg)、劑量3組(FFCGF 7 g 生藥/kg)、劑量4組(FFCGF 3.5 g生藥/kg)、劑量5組(FFCGF 1.75 g生藥/kg),每組12只小鼠,其中劑量5組相當于逍遙丸的人日服劑量?？瞻讓φ战M灌胃(ig)給予蒸餾水20 mL/(kg·d),各給藥組藥物溶于蒸餾水至相應濃度ig給藥,連續(xù)14 d,末次給藥后1 h。

2.1.2 行為絕望模型

2.1.2.1 小鼠懸尾實驗(TST)

在末次給藥后1 h,在距小鼠尾尖1 cm處使用用醫(yī)用膠帶粘住將其懸掛在小鼠懸尾實驗箱內(nèi),使每只小鼠均處于安靜且互不干擾的空間內(nèi),適應2 min,觀察后4 min內(nèi)小鼠的不動時間(四肢停止掙扎)[15]。

“古玩的價值并不在于器物本身，凝聚在器物上的時間和歷史才是真正價值所在。”葉總看王祥一臉不信，繼續(xù)說道。“剛才我看過你手里的玉墜，從樣式上看起來，這個是唐宋時期的款式，上面的紋飾看起來也是那個年代做工，要是我沒有看走眼，你的這批玉器來頭可不小啊?！?/p>

2.1.2.2 小鼠強迫游泳實驗(FST)

在末次給藥1 h 后,每只小鼠單獨置于一個裝有清潔水的透明圓柱形有機玻璃缸內(nèi),適應2 min,觀察后4 min內(nèi)小鼠的不動時間(四肢停止掙扎)。實驗過程中水溫保持在(25±1)℃,每只小鼠測試完畢后應及時換水,保證每組水質無差異。測試完成后立即用毛巾擦干并將小鼠歸籠[15]。

2.2 抗抑郁藥效驗證實驗

2.2.1 行為絕望模型

根據(jù)2.1部分有效劑量篩選結果進行抗抑郁藥效行為絕望模型驗證,設置空白對照組、陽性對照組(鹽酸文拉法辛膠囊0.05 g/kg)、FFCGF高劑量(28 g生藥/kg)、FFCGF中劑量(14 g生藥/kg)、FFCGF低劑量(7 g生藥/kg)、逍遙丸組(14 g生藥/kg),其中設置逍遙丸組的劑量相當于FFCGF的中劑量,用于對比基于逍遙散裁化而得的復方柴歸方與逍遙丸的抗抑郁作用。具體實驗動物及操作同2.1.2.1、2.1.2.2.

2.2.2 慢性溫和不可預知應激模型(CUMS)

2.2.2.1 實驗分組及給藥

大鼠適應1周后,根據(jù)第0周測定的糖水偏愛率基線、曠場實驗基線、體重基線劑量篩選的結果,將其隨機分為空白對照組、模型對照組、陽性對照組(鹽酸文拉法辛膠囊,0.035 g/kg)、中西聯(lián)合用藥組(FFCGF中劑量+鹽酸文拉法辛膠囊,9.7 g/kg+0.035 g/kg)、FFCGF高劑量(19.4 g生藥/kg)、FFCGF中劑量(9.7 g生藥/kg)、FFCGF低劑量(4.8 g生藥/kg)7個組,每組10只,并用苦味酸酒精溶液進行標號。空白對照組群養(yǎng)(5只/籠),其余各組均孤養(yǎng)。造模同時ig給藥,空白和模型對照組ig給予蒸餾水10 mL/(kg·d),各給藥組ig給予相應劑量的藥物,給藥1 h后給予刺激,持續(xù)28 d。

參照Willner等[16]方法并進行改進,刺激因子包括束縛,禁食,熱應激,禁水,超聲刺激,冰水浴,晝夜顛倒,夾尾,足底電擊等9種。每日1種,且每種刺激隨機3～4次,保證每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)持續(xù) 28 d。在實驗第0,7,14,21,28 d分別測定各組大鼠的體重、糖水偏愛率(糖水偏愛率=糖水消耗量/(糖水消耗量+純水消耗量)),以及曠場試驗中的穿越格數(shù)和直立次數(shù)。

2.3 統(tǒng)計分析

3 實驗結果

3.1 有效劑量篩選結果

小鼠FST、TST劑量篩選實驗結果(圖1)表明,與空白對照組對比,陽性對照藥文拉法辛組小鼠不動時間極顯著降低(P<0.01);FFCGF劑量1組和劑量2組不動時間具有極顯著差異(P<0.01),劑量3組具有顯著差異(P<0.05),劑量4組～劑量5組沒有顯著性差異(P>0.05)。說明FFCGF劑量在組3(7 g生藥/kg)～組1(28 g生藥/kg)時,可以顯著降低小鼠FST、TST不動時間,緩解小鼠“絕望”狀態(tài)。

3.2 抗抑郁藥效驗證試驗結果

3.2.1 行為絕望模型結果

小鼠TST、FST藥效驗證實驗結果(圖2)表明,與空白對照組對比,各給藥組小鼠不動時間均顯著降低,其中陽性藥文拉法辛、逍遙丸、FFCGF高劑量、中劑量組組有極顯著差異(P<0.01)。這說明FFCGF劑量在7 g生藥/kg～28 g生藥/kg時能夠緩解小鼠的“絕望”狀態(tài),其中14 g生藥/kg和28 g生藥/kg效果更好。

3.2.2 慢性溫和不可預知應激模型實驗結果

3.2.2.1 外觀及體重

在實驗前期的適應階段,大鼠體態(tài)外觀和行為活動均表現(xiàn)正常,在實驗過程中空白組大鼠也一直維持正常狀態(tài)。在實驗初期,各給藥組和模型組大鼠表現(xiàn)出明顯的易激惹、敏感等癥狀；在實驗后期,模型組大鼠出現(xiàn)明顯的行為活動減少、毛色枯槁、糞便粒數(shù)小且數(shù)量多等癥狀。

由圖3可知,各組在實驗期間體重均呈明顯上升趨勢。其中,與空白對照組相比,模型組在第7天開始體重出現(xiàn)極顯著性差異(P<0.01);與模型組相比,FFCGF各組在第7天開始體重出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),陽性藥文拉法辛在第21天大鼠體重出現(xiàn)顯著性差異(P<0.05),在第21天之后,各給藥組大鼠體重均高于模型組且具有顯著性差異(P<0.05,P<0.01),說明文拉法辛和FFCGF能夠改善由于CUMS模型引起的體重增長緩慢的狀態(tài)。FFCGF各組從第7天開始就能夠顯著調節(jié)CUMS引起的體重增長緩慢的狀態(tài)可以推測,FFCGF對緩解應激狀態(tài)下的食欲不振、消化系統(tǒng)功能減弱引起的體重增長緩慢狀態(tài)起效較快。由此可見,FFCGF在改善由于應激引起的食欲不振、消化功能減弱而導致的體重增長緩慢的狀態(tài)速度較快,效果較好。

圖1 FFCGF在TST、FST下劑量篩選與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01Fig.1 FFCGF dose screening under TST, FST vs the control group

圖2 FFCGF對TST、FST的影響與空白組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Effect of FFCGF on TST and FST vs. the control group

圖3 FFCGF對CUMS模型體重的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Effect of FFCGF on body weight of CUMS model##P<0.01 vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.2 糖水消耗實驗

由圖4可知,與空白對照組相比,從第14天開始,模型組糖水偏愛率顯著降低(P<0.05);與模型組相比,在造模第21天開始,所有給藥組的糖水偏愛率均顯著回調(P<0.01)。這說明CUMS應激模型能顯著降低大鼠糖水偏愛率,模擬快感缺失的癥狀,文拉法辛和FFCGF各劑量組均能回調糖水偏愛率,較好的改善這一癥狀。

圖4 FFCGF對CUMS模型糖水偏愛率實驗的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01Fig.4 Effect of FFCGF on CUMS model sucrose preference rate experiment #P<0.05,##P<0.01 vs. the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.3 曠場實驗

由圖5可知,與空白對照組相比,模型組在第14天開始大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)顯著降低(P<0.0.1);與模型組相比,在第21天時,文拉法辛組、聯(lián)合用藥組和FFCGF高劑量、中劑量組在回調大鼠曠場中穿越格數(shù)和直立次數(shù)指標中均出現(xiàn)極顯著差異(P<0.01),而FFCGF低劑量組在大鼠穿越格數(shù)出現(xiàn)顯著差異(P<0.05),在直立次數(shù)中并未出現(xiàn)顯著差異(P>0.05)。但低劑量組可延緩大鼠在曠場中穿越格數(shù)、直立次數(shù)降低的趨勢。在CUMS應激下,大鼠在曠場實驗中出現(xiàn)穿越格數(shù)、直立次數(shù)減少,說明CUMS模型能降低大鼠自主活動能力。在給藥組中,文拉法辛組、聯(lián)合用藥組、FFCGF高劑量、中劑量組均能回調穿越格數(shù)、直立次數(shù),說明FFCGF高劑量、中劑量組均能顯著緩解大鼠由于CUMS 應激引起的活動能力下降的狀態(tài)。

圖5 FFCGF對CUMS模型曠場實驗的影響與空白組比較:#P<0.05,##P<0.01;與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01.Fig.5 Effect of FFCGF on the CUMS model#P<0.05,##P<0.01vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

4 討論

逍遙散出自《太平惠民和劑局方》,具有疏肝解郁、調和脾胃之功效,主治肝郁血虛脾弱之癥[17]。本研究所用復方柴歸方是在逍遙散的基礎上進行拆方而來,本課題組前期通過對逍遙散抗抑郁活性部位進行研究發(fā)現(xiàn)其低極性部位抗抑郁作用顯著,通過成分歸屬并結合原湯劑在臨床上的加減方式用法,裁去生姜、茯苓而得復方柴歸方,采用前期篩選的復方柴歸方最佳提取工藝給藥,篩選抗抑郁有效劑量,驗證其抗抑郁藥效,并確定最佳抗抑郁劑量[18-21]。

本研究采用行為絕望模型和CUMS模型來進行抗抑郁劑量篩選和初步藥效學驗證。其中行為絕望模型包括TST、FST動物模型,利用動物不能逃出惡劣環(huán)境以致行為絕望的模型[22],是經(jīng)典的抗抑郁劑量篩選、藥效評價模型。CUMS抑郁模型主要模擬了快感缺乏這種人類抑郁的核心癥狀,同時模擬了輕、中度抑郁癥的臨床癥狀[23],是目前公認的經(jīng)典抑郁模型之一,常用于抗抑郁藥物篩選、抗抑郁藥物藥效評價、抗抑郁藥物作用機制及抑郁癥病理生理機制的研究。

劑量篩選實驗結果顯示FFCGF劑量在7 g生藥/kg時開始起效,且14 g生藥/kg和28 g生藥/kg抗抑郁效果較好。在有效劑量篩選時所選用的劑量5(1.75 g生藥/kg)相當于逍遙丸臨床人日服劑量,結果顯示,在該劑量下,FFCGF并沒有發(fā)揮抗抑郁作用。逍遙丸主要用于治療疏肝健脾,養(yǎng)血調經(jīng),并未提及治療肝郁脾虛型抑郁癥所需劑量,本實驗從側面驗證在該劑量(1.75 g生藥/kg)下逍遙丸無抗抑郁作用,故本實驗在進行藥效驗證時加入逍遙丸對照組來探討逍遙丸發(fā)揮抗抑郁作用所需劑量及其與FFCGF發(fā)揮抗抑郁作用關系。因此在進行行為絕望模型來驗證FFCGF抗抑郁藥效時,加入了逍遙丸、文拉法辛作為空白對照。

實驗中逍遙丸組所用劑量相當于FFCGF中劑量,逍遙丸表現(xiàn)出良好的抗抑郁作用,且抗抑郁療效與FFCGF中劑量相似,說明FFCGF在逍遙散的基礎上化裁去掉生姜、茯苓后的抗抑郁作用并未發(fā)生明顯改變,證明了基于逍遙散化裁和提取工藝的優(yōu)化而來的FFCGF具有重要開發(fā)價值。本實驗中FFCGF中劑量與逍遙丸給藥組劑量相當,相當于人日服逍遙丸248粒,說明逍遙丸發(fā)揮抗抑郁作用的劑量較大,FFCGF可以從服用劑量上發(fā)揮優(yōu)勢。

根據(jù)TST、FST實驗結果顯示,文拉法辛相較于逍遙丸和FFCGF在調節(jié)懸尾和強迫游泳引起的不動時間起效快,效果好等特點,但已上市藥物文拉法辛有胃腸道不適、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、視覺異常、打哈欠、出汗和性功能異常等不良反應[24],后期應對FFCGF是否具有副作用,且與西藥聯(lián)合用藥的“減毒增效”特點進行探討。

本實驗結果表明,聯(lián)合用藥組起效時間快于文拉法辛組,大鼠的穿越格數(shù)和直立次數(shù)在實驗的第14天顯著增加,且在糖水偏愛率的動態(tài)測定中平均值均高于文拉法辛,說明FFCGF與文拉法辛聯(lián)合使用抗抑郁療效優(yōu)于文拉法辛,符合中西藥聯(lián)合用藥“增效”的目的。聯(lián)合用藥組相較于陽性對照組文拉法辛在緩解CUMS應激狀態(tài)下食欲不振、消化功能減弱引起的體重增長緩慢有較好的效果,文拉法辛有胃腸道不適等不良反應,側面驗證聯(lián)合用藥組在保證藥效的前提下能夠降低文拉法辛的副作用,在一定程度上符合中西藥聯(lián)合用藥“減毒”的目的。

5 結論

本文對FFCGF進行抗抑郁有效劑量篩選,結果顯示7 g生藥/kg～28 g生藥/kg具有良好的抗抑郁 效果。通過對抗抑郁藥效驗證,顯示所篩得劑量下FFCGF具有良好的抗抑郁作用。根據(jù)本文實驗結果并結合前期單次給藥毒性實驗及最大耐受量實驗結果,選擇14 g生藥/kg為最佳抗抑郁劑量。