李秀娟,儀慧蘭,曾群

(1.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院,山西 太原 030006; 3.山西中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山西 太原 030024)

砷是環(huán)境中廣泛存在的一種類金屬元素。自然過程或人為因素(如采礦、金屬冶煉等)導(dǎo)致砷在一些地區(qū)的空氣、水或土壤中含量較高[1-2]。砷可通過呼吸吸入、食物和飲水?dāng)z入、皮膚吸收進(jìn)入人體,其中飲用含砷水是人群砷攝入的主要途徑[3-4]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),地下水砷含量超出世界衛(wèi)生組織(WHO)飲用水標(biāo)準(zhǔn)(10 μg/L)的國(guó)家有105個(gè),暴露人群達(dá)2億人[5]。我國(guó)約有1960萬人面臨著飲用高砷水的健康風(fēng)險(xiǎn)[6]。流行病學(xué)調(diào)查顯示,長(zhǎng)期飲用高砷水可引起呼吸急促、支氣管擴(kuò)張、肺功能下降等癥狀,誘發(fā)慢性咳嗽、肺炎、慢阻肺等呼吸道疾病[7-9],增加肺癌的發(fā)生率和死亡率[5,10-11]。研究表明,大鼠飲用含砷水4周后,肺組織發(fā)生炎性病理損傷[12]。小鼠灌胃含砷水或飲用含砷水后,肺促炎細(xì)胞因子及CD4+T細(xì)胞亞群分化相關(guān)基因表達(dá)改變[13]。小鼠孕期飲水砷暴露會(huì)影響子鼠肺臟發(fā)育,使肺容積、肺泡數(shù)量及表面積均明顯減小,肺黏液分泌(Clca3, Muc5b, Scgb3a1)、先天免疫(Reg3γ, Tff2, Dynlrb2, Lplunc1)及形態(tài)發(fā)生(Sox2)相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)[14]。體外實(shí)驗(yàn)證明,砷可改變?nèi)嗽夤苌掀ぜ?xì)胞(HBE)免疫球蛋白的表達(dá),降低肺上皮抵抗細(xì)菌感染的能力[15];砷還可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞M2極化,促進(jìn)人支氣管上皮細(xì)胞(BEAS-2B)間質(zhì)轉(zhuǎn)化[16]。經(jīng)口攝入砷可對(duì)肺臟產(chǎn)生毒效應(yīng),但慢性暴露對(duì)肺結(jié)構(gòu)及功能的影響目前還少見報(bào)道。

現(xiàn)有研究認(rèn)為,砷攝入會(huì)破壞機(jī)體原有的氧化還原平衡,砷誘發(fā)的炎癥、疾病及機(jī)體功能紊亂大多與其誘導(dǎo)的活性氧(ROS)水平增高相關(guān)[17-18]。本實(shí)驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象,檢測(cè)了長(zhǎng)期飲水?dāng)z入砷后小鼠肺的氧化應(yīng)激、組織結(jié)構(gòu)及免疫相關(guān)基因表達(dá)水平,探討砷對(duì)肺臟的損傷效應(yīng),為揭示慢性飲水砷暴露對(duì)呼吸道的毒性作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物染毒及取材

模擬居民飲水砷污染,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用自由飲用三價(jià)砷化物亞砷酸鈉(NaAsO2)水溶液的方式攝入砷。考慮到大部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物比人更耐受砷[19-20],同時(shí)結(jié)合課題組的前期研究,確定實(shí)驗(yàn)組的染毒劑量(以砷計(jì))為5 mg/L(略高于目前我國(guó)高砷暴露地區(qū)飲用水砷含量)或50 mg/L,對(duì)照組小鼠飲用蒸餾水。24只4周齡C57BL/6雄性小鼠(15±2 g,購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院),按體重隨機(jī)分為3組(n=8),標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)一周后開始染毒。實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由飲水,喂食山西醫(yī)科大學(xué)提供的全價(jià)營(yíng)養(yǎng)顆粒飼料,連續(xù)染毒180 d。染毒結(jié)束禁食12 h后,1%的戊巴比妥鈉麻醉小鼠,稱重、解剖,迅速取出肺組織,預(yù)冷的PBS(pH 7.4)漂洗后,左大葉肺于4%中性甲醛中固定,其余的肺組織液氮冷凍后-80℃保存。

1.2 石蠟切片的制備

固定好的肺組織經(jīng)梯度酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋后切片,蘇木素-伊紅(H&E)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3 組織氧化指標(biāo)測(cè)定

取100 mg左右凍存的肺組織,冰浴勻漿后3 500 r/min低溫離心15 min,取上清用于氧化指標(biāo)的測(cè)定。丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性及總抗氧化能力(T-AOC)測(cè)定均嚴(yán)格按試劑盒(南京建成)說明進(jìn)行,蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定[21]。

1.4 總RNA提取及定量PCR(qPCR)

Trizol法提取肺組織總RNA,去除基因組DNA后,以oligo dT為引物反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。參照qPCR試劑說明建立20 μL的反應(yīng)體系,每個(gè)樣本設(shè)兩個(gè)重復(fù)進(jìn)行基因擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法[22]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。IFN-γ基因(NM_008337)引物序列為F-P:5′AGCAACAGCAAGGCGAAAA-3′;R-P:5′CTGGACCTGTGGGTTGTTGA-3′,其余基因引物序列參照文獻(xiàn)[23]。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù),結(jié)果以Mean± SE表示。One-way ANOVA 法檢驗(yàn)各組之間的差異顯著性。*P<0.05,**P<0.01表示處理組與對(duì)照組間的差異顯著;#P<0.05,##P<0.01表示50 mg/L As組與5 mg/L As組間的差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 染毒小鼠一般情況

根據(jù)飲水量和體重計(jì)算5 mg/L As組和50 mg/L As組小鼠的砷攝入量分別為0.82 mg/(kg·d)和4.82 mg/(kg·d)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間小鼠生長(zhǎng)狀況良好,未出現(xiàn)死亡。與對(duì)照組相比,砷染毒后小鼠肺臟重量與體重的比值(臟體比)未發(fā)生顯著性變化。

圖1 砷暴露對(duì)小鼠肺組織T-SOD活性(A)、T-AOC(B)和MDA含量(C)的影響Fig.1 Effects of arsenic on T-SOD activity (A) T-AOC (B),and MDA content (C) in mouse lungs

注:A：對(duì)照組; B：5 mg/L As組; C：50 mg/L As組圖2 小鼠肺組織切片(×200,標(biāo)尺=100 μm)Fig.2 Characteristics of the mouse lungs

2.2 砷對(duì)小鼠肺組織的氧化損傷效應(yīng)

小鼠飲用含砷水180 d后,肺組織T-SOD活性和T-AOC均顯著降低,50 mg/L As組小鼠肺MDA含量顯著增高(圖1),表明砷暴露抑制了活性氧清除酶T-SOD活性及組織總抗氧化能力,打破了肺組織細(xì)胞的氧化還原平衡,造成肺組織氧化損傷。

2.3 砷對(duì)小鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

觀察肺組織結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn),對(duì)照組小鼠肺泡結(jié)構(gòu)清晰,肺泡空間大,肺泡壁較薄(圖2A);5 mg/L As組小鼠的肺泡囊縮小,肺泡隔增厚,肺組織有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B);50 mg/L As組小鼠肺泡囊普遍較小,肺泡隔明顯增厚,并伴有肺泡隔的斷裂和融合,炎性細(xì)胞明顯增多(圖2C)。結(jié)果表明,飲水砷暴露誘發(fā)了小鼠肺臟組織結(jié)構(gòu)的損傷,且損傷具有劑量依賴性。

2.4 砷對(duì)小鼠肺IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響

IFN-γ是輔助性T細(xì)胞1(Th1)的標(biāo)志性細(xì)胞因子,作為強(qiáng)有力的巨噬細(xì)胞活化因子,可促進(jìn)炎癥的發(fā)生。與對(duì)照組相比,5 mg/L As組小鼠肺IFN-γ mRNA水平有增高趨勢(shì),但未出現(xiàn)顯著差異,50 mg/L As組IFN-γ mRNA水平呈極顯著增高(圖3),表明一定水平的砷攝入可誘導(dǎo)肺組織中促炎細(xì)胞因子IFN-γ的表達(dá)。此結(jié)果與肺組織結(jié)構(gòu)炎性損傷結(jié)果(圖2)一致。

圖3 砷暴露對(duì)小鼠肺組織IFN-γ基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Effects of arsenic on IFN-γ mRNA level in mouse lungs

2.5 砷對(duì)小鼠肺Th2細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄的影響

Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5及IL-13等細(xì)胞因子,其中IL-4是決定Th2細(xì)胞分化的關(guān)鍵細(xì)胞因子。IL-4、IL-5和IL-13基因在5 mg/L As組表達(dá)水平無明顯改變,在50 mg/L As組均顯著降低(圖4A-C),說明高劑量砷能抑制肺組織中Th2細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄。同期,IL-4/IFN-γ mRNA比值顯著下降(圖4D),提示砷暴露組小鼠肺組織出現(xiàn)了免疫失衡,表現(xiàn)為Th1反應(yīng)增強(qiáng),Th2反應(yīng)抑制。

圖4 砷暴露對(duì)小鼠肺組織IL-4,IL-5和IL-13基因轉(zhuǎn)錄及IL-4/IFN-γ值的影響Fig.4 Effects of arsenic on the mRNA levels ofTh2 cytokines and the ratio of IL-4/IFN-γ mRNA in mouse lungs

3 討論

高砷地下水廣泛存在于世界各地,通過飲水慢性攝入砷可誘導(dǎo)機(jī)體多個(gè)器官或組織損傷[5,18]。本研究表明,通過飲水?dāng)z入砷會(huì)造成小鼠肺組織結(jié)構(gòu)損傷及免疫失衡,砷對(duì)肺臟的毒效應(yīng)可能與砷暴露引發(fā)的細(xì)胞氧化損傷相關(guān)。

無機(jī)砷在細(xì)胞內(nèi)的甲基化代謝過程會(huì)產(chǎn)生大量ROS[18]。此外,砷對(duì)巰基(-SH)有很高的親和力,可以與含-SH的功能蛋白、酶及小分子化合物發(fā)生反應(yīng),干擾細(xì)胞的正常代謝,抑制多種抗氧化酶活性及抗氧化物質(zhì)水平,最終導(dǎo)致ROS水平的增加[5]。ROS可攻擊細(xì)胞的蛋白質(zhì)、脂類和DNA等生物大分子,破壞分子結(jié)構(gòu),引起細(xì)胞生理功能紊亂,誘導(dǎo)疾病的發(fā)生。本研究砷組小鼠肺T-SOD活性及總抗氧化能力下降,說明砷攝入抑制了內(nèi)源性抗氧化酶及抗氧化物質(zhì)的活性,機(jī)體清除自由基的能力下降,使同期體內(nèi)產(chǎn)生的過量自由基不能及時(shí)清除,引發(fā)肺臟組織氧化損傷,MDA升高。已有研究表明,白藜蘆醇可通過提高機(jī)體抗氧化能力緩解砷攝入對(duì)大鼠肺組織的損傷[24]。因此,我們推測(cè)本研究砷暴露引起肺組織結(jié)構(gòu)的改變可能與其誘導(dǎo)的氧化損傷相關(guān)。

已有研究表明,高水平的ROS可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達(dá),誘發(fā)炎癥[25]。本研究在小鼠飲用含砷水180 d后檢測(cè)到IFN-γ表達(dá)水平的升高,并觀察到肺組織中炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明砷攝入引發(fā)了小鼠肺臟的炎癥反應(yīng)。炎癥發(fā)生時(shí)往往會(huì)伴隨中性粒細(xì)胞的增多,而壞死的中性粒細(xì)胞會(huì)釋放蛋白溶解酶,破壞肺泡彈性纖維,導(dǎo)致肺泡彈性減弱,影響正常呼吸。砷染毒組小鼠肺臟組織中增厚的肺泡隔和縮小的肺泡囊會(huì)影響肺部氣體交換,導(dǎo)致肺功能下降。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肺臟炎癥和病理性損傷與砷暴露人群中出現(xiàn)的呼吸急促、肺功能下降、慢性咳嗽、肺炎等癥狀一致。

輔助性T細(xì)胞亞群Th1和Th2的平衡在炎癥和免疫過程中發(fā)揮重要作用。Th1細(xì)胞主要參與細(xì)胞免疫,介導(dǎo)細(xì)胞毒和局部炎癥相關(guān)的免疫應(yīng)答;Th2細(xì)胞可促進(jìn)IgE介導(dǎo)的超敏反應(yīng)和體液免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞可通過負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制抑制Th1免疫反應(yīng)而發(fā)揮抗炎作用,而Th2免疫反應(yīng)的減弱也會(huì)促進(jìn)Th1驅(qū)動(dòng)的炎癥發(fā)生[26]。本研究小鼠飲水砷暴露180 d后,5 mg/L As組肺IL-4/IFN-γ mRNA比值顯著降低,50 mg/L As組IFN-γ mRNA水平極顯著增高,Th2細(xì)胞因子基因表達(dá)均顯著下調(diào),IL-4/IFN-γ mRNA比值極顯著降低,表明長(zhǎng)期飲水?dāng)z入砷可引起小鼠肺組織Th1/Th2免疫失衡,表現(xiàn)為Th1炎癥反應(yīng)增加,Th2抗炎反應(yīng)減弱。已有文獻(xiàn)報(bào)道,昆明小鼠單次灌胃2.5-10 mg/kg NaAsO2水溶液,24 h后肺組織Th2優(yōu)勢(shì)應(yīng)答,抗炎反應(yīng)增強(qiáng);C57BL/6小鼠連續(xù)飲用100 mg/L NaAsO2水溶液90 d后,肺Th1和Th2細(xì)胞因子均被誘導(dǎo)表達(dá)[13]。上述文獻(xiàn)中急性和亞慢性砷暴露的肺免疫反應(yīng)與本研究結(jié)果不同,可能與所選小鼠的品系、染毒劑量及染毒時(shí)間不同有關(guān)[27]。

4 結(jié)論

長(zhǎng)期經(jīng)口攝入一定劑量的砷可誘導(dǎo)小鼠肺氧化損傷,引起肺組織結(jié)構(gòu)改變和免疫失衡。低劑量砷攝入造成了輕微的肺組織病理損傷;攝入高劑量砷誘導(dǎo)了肺組織脂質(zhì)過氧化損傷和免疫失衡,Th1炎癥反應(yīng)加強(qiáng),小鼠肺組織損傷加重。