孫亞文,張學(xué)堯,張敏,劉曉健*

(1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

0 引言

飛蝗(Locustamigratoria)是一種破壞性極強(qiáng)的世界性農(nóng)業(yè)害蟲。頻繁大劑量地利用化學(xué)殺蟲劑防治飛蝗造成一系列的后果,如農(nóng)藥殘留危害非靶標(biāo)生物及昆蟲自身產(chǎn)生抗藥性[1-3]等。蛻皮是昆蟲發(fā)育變態(tài)中非常關(guān)鍵的生命過程,亦是害蟲控制的理想靶標(biāo)。

昆蟲蛻皮受保幼激素(juvenile hormone,JH)和蛻皮激素(20-hydroxyecdysone, 20E)的協(xié)同調(diào)控[4-5]。20E通過與20E受體EcR和超氣門蛋白USP結(jié)合形成的異源二聚體,激活一系列初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子(如E74,E75,Broad等)的表達(dá),這些基因再調(diào)控下游效應(yīng)基因表達(dá),最終使昆蟲順利完成蛻皮[6-9]。E74已在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)[10-13]、家蠶(Bombyxmori)[14]、煙草天蛾(Manducasexta)[15]、馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsadecemlineata)[16]、埃及伊蚊(Aedesaegypti)[17]等完全變態(tài)昆蟲有較深入的研究。E74可分為轉(zhuǎn)錄激活域(Trans-activation domain)、鉸鏈域(Linker region)、核定位域(Nulear localization motif)、ETS域(ETS domain)、F域5個(gè)區(qū)域,其中ETS結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是位置特異性的DNA結(jié)合域。由于轉(zhuǎn)錄激活域結(jié)構(gòu)的不同,E74可分為A和B兩種同型異構(gòu)體。

飛蝗是典型的不完全變態(tài)昆蟲,本文克隆獲得了LmE74A基因的cDNA序列,并對其mRNA表達(dá)特性、調(diào)控及功能進(jìn)行了分析,在生物學(xué)特性差異較大的昆蟲中開展E74A基因分子特性及功能的研究,對于全面了解激素調(diào)控昆蟲蛻皮的信號(hào)傳導(dǎo)途徑具有重要的生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)材料飛蝗蟲卵購買于蝗蟲養(yǎng)殖公司(河北滄州),在溫度為(30±2)℃,濕度為(40±10)%,光照14 h:黑暗10 h的人工氣候箱中進(jìn)行孵化。將孵化出的1齡若蟲轉(zhuǎn)移至縫制的紗籠中,飼喂新鮮的小麥幼苗,在3齡若蟲期之后添加麥麩。

1.2 供試藥品

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1LmE74A基因全長cDNA序列獲得

在飛蝗的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜索,得到E74基因的全長cDNA序列。在NCBI里進(jìn)行Blast分析,將其命名為LmE74A并確定其結(jié)構(gòu)域。使用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)E74A基因的全長引物,引物信息見表1。以飛蝗總cDNA為模板,通過PCR法驗(yàn)證獲得的E74A的全長序列。之后利用ExPASy(http:∥www.expasy.org/)網(wǎng)站確定LmE74A開放閱讀框并預(yù)測等電點(diǎn)及分子量。

1.3.2LmE74A基因的mRNA表達(dá)特性

通過Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)LmE74A和β-Actin內(nèi)參基因的特異性表達(dá)引物(表1),通過RT-qPCR技術(shù)分析LmE74A基因在五齡第6天(N5D6)的體壁、前腸、中腸、后腸、胃盲囊、馬氏管、脂肪體、翅8個(gè)組織和五齡若蟲不同發(fā)育天數(shù)的體壁中mRNA表達(dá)特性。由于在上述實(shí)驗(yàn)條件下飛蝗五齡發(fā)育期共8天,因此我們從第一天開始到第八天結(jié)束進(jìn)行體壁的取材,即N5D1-N5D8?？俁NA提取使用RNAisoPlus試劑,之后在NANODROP 2000上定量,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄酶說明書將1.0 μg 的總RNA 合成cDNA。RT-qPCR反應(yīng)體系為20 μL:10 μL SYBRGreen real-time PCR Master Mix;2 μL cDNA (10×);0.4 μmol/L F/R引物; 6.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15 s,變性95℃ 15 s,退火60℃ 31 s,40個(gè)循環(huán)。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)生物學(xué)重復(fù)3頭試蟲,每個(gè)樣品2個(gè)技術(shù)學(xué)重復(fù)。利用2-ΔCT的方法計(jì)算LmE74的mRNA相對表達(dá)量。數(shù)據(jù)用SPSS Tukey’s HSD進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P<0.05 為差異顯著。

1.3.3 20E誘導(dǎo)

為了檢測飛蝗LmE74A是否受20E的調(diào)控,用10%的乙醇將20E稀釋成終濃度5 μmol/L備用,在五齡第1 d若蟲體腔內(nèi)注射10 μg 20E,同時(shí)以相同體積的10%的乙醇作為對照,分別在30 min, 1 h, 3 h, 6 h, 12 h之后取飛蝗第2-3體節(jié)的體壁凍存于液氮中用于提取RNA,通過RT-qPCR技術(shù)檢測LmE74A在對照組和20E注射組的表達(dá)量,6頭試蟲組成一個(gè)生物學(xué)重復(fù),對照組和20E注射組分別設(shè)4個(gè)重復(fù)，共計(jì)48頭試蟲,RNA提取,cDNA反轉(zhuǎn)錄、RT-qPCR的具體操作同上。

表1 LmE74A研究中使用的引物

1.3.4LmE74A基因的功能分析

在E-RNAi網(wǎng)站設(shè)計(jì)LmE74A基因的dsRNA引物,通過PCR擴(kuò)增獲得體外合成LmE74A基因dsRNA的模板。按照T7 RiboMAXTMExpress RNAi System說明書合成dsRNA。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測dsRNA是否單一并定量至終濃度為3 μg/μL,保存至-80℃?zhèn)溆?。注射LmE74A基因的dsRNA于五齡第1天(N5D1)的飛蝗若蟲體腔內(nèi),并在五齡第3天(N5D3)進(jìn)行dsLmE74A的補(bǔ)注實(shí)驗(yàn),每頭每次15 μg,并設(shè)置對照組。設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù),每個(gè)重復(fù)對照和實(shí)驗(yàn)組各15頭若蟲,一共45頭試蟲。在補(bǔ)注dsLmE74A后的48 h即五齡第5天(N5D5)收集實(shí)驗(yàn)組和對照組的飛蝗體壁各9頭,3頭一個(gè)重復(fù),采用RT-qPCR檢測LmE74A的表達(dá)量。其余的試蟲置于燒杯中進(jìn)行飼養(yǎng)用于觀察其生長狀態(tài),記錄異常的表型和死亡率。

2 結(jié)果與分析

2.1 LmE74A基因的cDNA序列分析

在飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫搜索得到E74A基因的cDNA序列,通過NCBI中Blast比對分析表明LmE74A為全長序列,命名為LmE74A,GenBank登錄號(hào)為:MK568625。開放閱讀框?yàn)? 539 bp,編碼512個(gè)氨基酸,預(yù)測LmE74A蛋白的分子量為54.9 KDa,等電點(diǎn)為6.25。如圖1所示LmE74A的ETS域與赤擬谷盜、家蠶、煙草天蛾和馬鈴薯甲蟲的ETS域一致度幾乎100%。

注:下劃線標(biāo)注ETS域圖1 飛蝗LmE74A與其他昆蟲E74A的氨基酸比對圖Lm:Locusta migratoria 飛蝗; Ld:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata;Bm:Bombyx mori 家蠶;Tc: Tribolium castaneum赤擬谷盜;Ms:Manduca sexta煙草天娥Fig.1 Alignment E74A among L. migratoria and other insects(the ETS domain was underlined).

2.2 LmE74A基因在五齡若蟲期不同組織部位的表達(dá)

RT-qPCR的結(jié)果表明:LmE74A在體壁中的表達(dá)量顯著高于前腸和后腸,胃盲囊、中腸、脂肪體、馬氏管和翅的表達(dá)量最低(圖2)

柱形圖上不同的字母代表基因表達(dá)差異顯著(P<0.05,Tukey’s HSD;n=3)。注:IN (Integument):體壁;FG (Foregut):前腸;MG (Midgut):中腸;GC (Gastric caeca):胃盲囊;HG (Hindgut):后腸;FB (Fat body):脂肪體;MT (Malpighian tubules):馬氏管; WI (Wing):翅。圖2 飛蝗五齡若蟲期不同組織部位LmE74A基因的表達(dá)Different letters on the bars of the histogram indicated statistically significant difference (P<0.05, Tukey’s HSD; n=3)。the same for the following figures.Fig.2 Expression of LmE74A gene in differenttissues of the 5th instar nymphs of L. migratoria

2.3 LmE74A基因在五齡若蟲期不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)

RT-qPCR的結(jié)果表明:LmE74A在第五天中表達(dá)量最高,蛻皮前后表達(dá)量較低(圖3)。

圖3 飛蝗五齡不同發(fā)育天數(shù)LmE74A基因的表達(dá)Fig.3 Expression of LmE74A gene in different days of the 5th instar nymphs of L. migratoria

2.4 20E誘導(dǎo)

為了檢測飛蝗LmE74A是否受20E的調(diào)控,對5 齡第1天若蟲進(jìn)行20E注射,通過RT-qPCR檢測注射20E之后不同時(shí)間點(diǎn)LmE74A表達(dá)量。結(jié)果顯示(圖4),與對照組比較,LmE74A在注射20E 1 h、3 h、12 h后表達(dá)量顯著升高。

注:無顯著差異P>0.05;*:差異顯著P<0.05;***:差異極顯著P<0.001,Student’s t test。圖4 體內(nèi)注射20E不同時(shí)間后LmE74A的相對表達(dá)量NS:No significant difference P>0.05;*:significant difference P<0.05;***:greatly significant difference P<0.001。the same for the following figuresFig.4 Relative expression of LmE74A after 20E injection in vivo at different times

2.5 LmE74A基因的功能分析

為進(jìn)一步探索LmE74A在飛蝗蛻皮過程中的功能,在第二次注射LmE74A的雙鏈RNA 48 h后,取飛蝗體壁樣品提取RNA,通過RT-qPCR技術(shù)檢測LmE74A基因的表達(dá)量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,注射dsLmE74A組的飛蝗LmE74A的表達(dá)能夠被顯著抑制(圖5)。但注射dsLmE74A后并不影響昆蟲的蛻皮,實(shí)驗(yàn)組試蟲均能夠正常羽化為成蟲。

圖5 飛蝗五齡若蟲期注射dsLmE74A后對LmE74A基因表達(dá)量的影響Fig.5 Effect on the LmE74A gene expression after the injection of dsLmE74A into the 5thinstar nymphs of L. migratoria

3 討論

蛻皮是線蟲和節(jié)肢動(dòng)物等蛻皮類生物特有的生命現(xiàn)象,是昆蟲發(fā)育變態(tài)的重要程序之一。從分子生理學(xué)的角度看,昆蟲蛻皮是由一個(gè)激素網(wǎng)絡(luò)所協(xié)同調(diào)控的復(fù)雜生命過程[4-5]。由于昆蟲在蛻皮時(shí)不吃少動(dòng),對作物沒有危害,因此,昆蟲蛻皮一直是害蟲控制的研究靶標(biāo)。本文克隆獲得了飛蝗轉(zhuǎn)錄因子LmE74A的全長cDNA序列,其開放閱讀框?yàn)? 539 bp,編碼512個(gè)氨基酸。與其他已知物種的基因結(jié)構(gòu)域一致,LmE74A自N端起分為A/B域轉(zhuǎn)錄激活域由308個(gè)氨基酸組成、C域鉸鏈域由98個(gè)氨基酸組成、D域核定位域由8個(gè)氨基酸組成、E域ETS域由85個(gè)氨基酸組成和F域由13個(gè)氨基酸組成。并且LmE74A的氨基酸序列與其他物種的相似度極高,其中與馬鈴薯甲蟲(L.decemlineata)的氨基酸一致度高達(dá)57.8%,與煙草天娥(M.sexta)的氨基酸一致度也達(dá)到了54.8%。其中ETS域和核定位域(KR/KXR/K被認(rèn)為是核定位的信號(hào))分別與果蠅、家蠶和煙草天蛾的ETS域和核定位域表現(xiàn)出幾乎100%的一致度。

已有研究表明:飛蝗五齡期只有蛻皮激素,沒有保幼激素,因此我們選擇五齡期進(jìn)一步分析了LmE74A基因的mRNA時(shí)空表達(dá)特性、20E誘導(dǎo)及生物學(xué)功能。結(jié)果顯示:LmE74A基因具有多組織分布特性,在五齡發(fā)育時(shí)期體壁表達(dá)量最高,隨后是前腸和后腸,其余組織部位表達(dá)量均較低。E74基因組織分布特性在其他物種中也有相關(guān)的報(bào)道,如果蠅DmE74A在腦和脂肪體等組織高表達(dá)[10],馬鈴薯甲蟲LdE74A在中腸組織高表達(dá)[15],表明這些組織的發(fā)育可能受蛻皮激素的調(diào)控。而LmE74A在五齡第5天中表達(dá)量最高,蛻皮前后表達(dá)量較低。這與20E在五齡期滴度變化趨勢一致,推測LmE74A可能受20E的調(diào)控[18]。事實(shí)上,我們通過體內(nèi)注射20E后可誘導(dǎo)LmE74A的表達(dá)上調(diào),進(jìn)一步證實(shí)LmE74A受20E的調(diào)控。之后我們通過RNAi實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)LmE74A在注射dsLmE74A組可以顯著沉默,但注射dsLmE74的試蟲仍能成功羽化為成蟲,說明LmE74A在飛蝗五齡發(fā)育過程中不是必需的。這與完全變態(tài)昆蟲中對E74功能的研究不同,如在果蠅中發(fā)現(xiàn),DmE74B突變個(gè)體出現(xiàn)蛹?xì)と毕荨㈩^部翻轉(zhuǎn)困難等現(xiàn)象,而DmE74A雖然正常蛹化,但最終在預(yù)蛹期或蛹期死亡[11,14],馬鈴薯甲蟲中,注射dsLdE74的個(gè)體出現(xiàn)化蛹率低,附肢短小等表型[15]。

目前對于20E的信號(hào)傳導(dǎo)途徑在完全變態(tài)昆蟲里研究的較多,蛻皮激素如何順序啟動(dòng)初級(jí)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)并最終導(dǎo)致昆蟲蛻皮,迄今為止仍然是昆蟲學(xué)領(lǐng)域的重要科學(xué)問題。本文首次在漸變態(tài)昆蟲飛蝗中研究了LmE74A基因的分子特性、調(diào)控及功能,對于全面了解激素調(diào)控的信號(hào)通路具有重要的生物學(xué)意義,并為基于激素調(diào)控的害蟲防治提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。