陳金祥,楊靜,劉淑珍,姚靜陽(yáng),郭彥鑫,王田田

(中北大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院,山西 太原 030051)

0 引言

多酚是一類植物特有的多羥基次生代謝物,具有很好的抗氧化活性,根據(jù)是否含有C6-C3-C6母核結(jié)構(gòu),又分為黃酮類和非黃酮類兩個(gè)亞類,其抗氧化能力強(qiáng)弱與酚羥基的數(shù)量和位置直接相關(guān)[7]。茶葉中的茶氨酸和茶多酚具有良好的抗自由基作用,作為三大飲品之一為人類健康做出巨大貢獻(xiàn),而茶葉生產(chǎn)中的邊角料和老葉都可以成為茶多酚生產(chǎn)的原料。2006年,第一個(gè)以茶多酚為主要原料的植物處方新藥(Veregen)被美國(guó)FDA批準(zhǔn),無疑為植物醫(yī)藥制劑的發(fā)展注入了新的活力[8]。1969年北京制藥廠研制銀杏黃酮制劑6911(舒血寧和冠也麗)是我國(guó)工業(yè)化植物多酚應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)的開始。銀杏葉多酚提取物中黃酮含量超過25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),主要活性物質(zhì)為山柰酚,山柰酚可以通過抑制酒精對(duì)小鼠肝臟的氧化損傷來達(dá)到抗癌的作用[9]。葡萄籽多酚提取物中主要成分是低聚原花青素,它比松樹皮和花生紅衣多酚提取物中的高聚原花青素生理活性高[10]。葡萄和虎杖中的白藜蘆醇能通過抑制氧化應(yīng)激來有效地推遲小鼠糖尿病腎病引起的腎臟纖維化等功效[11],是保健品原料之一。懸鉤子屬植物中多種樹莓、黑莓不僅是高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的經(jīng)濟(jì)水果,還富含鞣花酸、花青素等高活性化合物,具有高多酚的特點(diǎn),特別是紅樹莓葉片為少數(shù)含有槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的植物材料之一,槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷可以抑制胰腺癌細(xì)胞的遷移而達(dá)到抗癌的效果[12]。因此高總酚含量的植物材料具有很大的開發(fā)利用空間。

本文以藥用[13]、藥食同源、食葉植物和潛在植物源多酚植物為基礎(chǔ)[14-15],選取5種茶葉、35種常用藥材和樹莓等[16]14種自制材料,共54種,通過使用福林酚法和鋁鹽顯色法分別對(duì)總酚和總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定,用FRAP法測(cè)定其總抗氧化能力,用兩種常用的DPPH法和ABTS法測(cè)定其清除自由基的能力,分析這些指標(biāo)的相關(guān)性,為植物源多酚材料的選擇和開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杠板歸等35種植物藥材購(gòu)自山西省仁和大藥房(2017-2018年);5種茶葉分別為六安瓜片(2017年,安徽)、翠尖茶(2018年,安徽)、碧螺春(2017年,安徽)、云南普洱茶(2012年,云南)、云霧茶(2017年、云南),樹莓等14種植物材料為自制材料。14種自制材料均在自然條件下陰干至恒重:樹莓、黑莓、草莓葉和銀杏葉等11種材料采自山西太原北郊中北大學(xué)試驗(yàn)田(E111°,N37°,2018年);葡萄籽、石榴籽和核桃皮均于2018年購(gòu)于市場(chǎng)。各植物材料拉丁名詳見表1,全部標(biāo)本保存于中北大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院植物質(zhì)資源研究所。

蘆丁、沒食子酸、山柰酚、原花青素、木犀草苷、芹菜素、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均購(gòu)自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司,批號(hào)分別為150806、150829、150828、150429、150919、150823、150616;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)購(gòu)自酷爾化學(xué)科技有限公司,批號(hào)分別為E5142535和54C1201V;福林酚試劑、過硫酸鉀、硫酸亞鐵、氯化鐵等購(gòu)自天津市申泰化學(xué)試劑有限公司。

Lamda 35 紫外可見光譜分辨儀(珀金埃爾默股份有限公司),KQ-250DE型超聲清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司),TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.2 提取物制備

取干燥的植物材料粉碎,過40目篩子,準(zhǔn)確稱取0.1 g粉末,按照料液比為1∶40 g/mL加入4 mL體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液,混合搖勻,在超聲清洗儀超聲提取,超聲條件為60℃、120 W、40 Hz、30 min,提取液于12 000 r/min離心10 min,上清液儲(chǔ)藏于4℃冰箱備用[17]。

1.3 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量測(cè)定

參考許海棠等[18]總酚含量測(cè)定方法,以質(zhì)量濃度(X)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行回歸,沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。沒食子酸在0.05～0.25 mg/mL內(nèi)線性良好, 回歸方程為:Y=1.809X+0.006,R2=0.998。對(duì)各植物提取液進(jìn)行測(cè)定,并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出總酚含量,總酚含量單位mg/g。

1.4 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線及含量測(cè)定

參考韓紅娟等[19]總黃酮含量測(cè)定方法,以質(zhì)量濃度(X)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行回歸,蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。蘆丁在0.01-0.06 mg/mL內(nèi)線性良好,回歸方程為:Y=13.334X+0.001,R2=0.999。對(duì)各植物提取液進(jìn)行測(cè)定,并按標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出總黃酮含量,總黃酮含量單位mg/g。

1.5 總抗氧化能力測(cè)定

參考Katalinic等[15]總抗氧化能力/鐵離子還原(Ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)測(cè)定方法,以摩爾濃度(X)對(duì)吸光度(Y)進(jìn)行回歸,硫酸亞鐵為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。硫酸亞鐵在0.02～0.12 μmol內(nèi)線性良好,回歸方程為:Y=5.114X+0.140 2,R2=0.999。對(duì)各植物提取液進(jìn)行測(cè)定,并參照硫酸亞鐵標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出鐵離子還原量,以鐵離子還原量表示總抗氧化能力。單位:μmol。

1.6 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考Piangsiong等[20]DPPH·清除能力測(cè)定方法,以體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液為空白調(diào)零,2 mL提取液與2 mL DPPH·反應(yīng)液混合,避光反應(yīng)40 min,在510 nm測(cè)得的吸光度記為A1,體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液(或者無樣品的溶劑)與DPPH·反應(yīng)液混合后測(cè)得的吸光度記為A2,計(jì)算清除率,公式為:清除率(%)=(1-A1/A2)×100%。

1.7 ABTS自由基清除能力測(cè)定

參照Rodriguez-Bonilla等[7]ABTS自由基清除能力測(cè)定方法,以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液為空白調(diào)零,1 mL提取液與3 mL ABTS反應(yīng)液混合,避光反應(yīng)6 min,測(cè)得的吸光度值記為A1,體積分?jǐn)?shù)60%乙醇(或者無樣品的溶劑)與ABTS反應(yīng)液混合測(cè)得吸光度值為A2,計(jì)算清除率,公式為:清除率(%)=(1-A1/A2)×100%。

1.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行單因素方差分析和線性回歸分析,采用Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 54種材料的總酚含量和分組

參照Katalinic等[15]的方法,按照總酚含量將54種材料分為5組(如表1)。A組(極高總酚組):總酚含量>200 mg/g, 4種綠茶,這與茶葉富含茶多酚,具有抗氧化的健康價(jià)值研究結(jié)果一致[21]。B組(高總酚組):總酚含量100～200 mg/g,包括8種植物材料。杠板歸、石榴皮和荷葉屬于已被大量使用的藥用材料,兼顧藥用價(jià)值和高總酚特點(diǎn)。杠板歸、荷葉和樹莓一樣是少數(shù)幾種含有槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的植物[12],另外,荷葉提取物的總抗氧化能力遠(yuǎn)大于維生素E[22]。葡萄籽總酚含量在100 mg/g以上,具有很強(qiáng)的抗氧化能力,葡萄籽提取物以原花青素為主,其鐵離子還原能力是人工抗氧化劑2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)的10倍以上[23]。C組(中總酚組):總酚含量50～100 mg/g,包括11種植物材料,7種為藥用材料。銀杏葉片總酚和總黃酮的排序不高,可能與所收集葉片的采收期采收地有關(guān),也與銀杏黃酮主要成分是山柰酚,在鋁鹽顯色法中效果不好有關(guān)[9]。D組(低總酚組),總酚含量10～50 mg/g,包括28種植物材料,23種為藥用材料,這些中藥材有特定的藥理作用和相應(yīng)的化合物組分,可能與高總酚關(guān)系不大。紅樹莓鮮果、黑莓和紅樹莓種子、爬山虎和草莓葉片5種普通植物材料的總酚含量也不高,不太適合作為提取多酚的首選材料。E組(極低總酚組):總酚含量<10 mg/g,包括3種植物材料。柴胡和白果是常用中藥,從測(cè)定結(jié)果看也不以總酚含量高見長(zhǎng)。石榴籽看上去和葡萄籽類似,但是總酚含量遠(yuǎn)不如葡萄籽,也不適合提取多酚用。本試驗(yàn)選取的54種植物與劉海英等選取的86種藥食兩用的藥材具有部分的重疊,例如甘草、澤蘭葉、紫蘇葉等,其總酚含量與試驗(yàn)結(jié)果類似[14]?？傮w來看,B組材料的總酚含量在100 mg/g以上,雖然不能與直接食葉用的茶葉總酚相比,但是可以作為潛在的植物多酚提取材料,特別是藥用以外的黑莓和紅樹莓葉片和核桃殼,它們類似于葡萄籽都屬于農(nóng)副產(chǎn)品廢棄物,具有變廢為寶的開發(fā)價(jià)值和大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化開發(fā)的潛質(zhì)。

表1 54種植物材料總酚及其他指標(biāo)匯總

表2 各個(gè)指標(biāo)間顯著性分析

圖1 總酚含量與總抗氧化能力(FRAP)線性擬合圖Fig.1 Linear correlation between the amount of total phenolic content and antioxidant capacity (FRAP)

2.2 54種植物總酚含量與總抗氧化能力比較分析

2.2.1 總酚與鐵離子還原量相關(guān)性分析

各植物材料提取液的抗氧化能力經(jīng)由FRAP法測(cè)得,總酚與各抗氧化能力相關(guān)性分析如表2所示,總酚含量與鐵離子還原量(μmol)顯著相關(guān)(P<0.01),其中相關(guān)因子,r=0.987。將總酚含量(X)與鐵離子還原量(Y)進(jìn)行線性擬合,擬合曲線如圖1所示,擬合方程為:Y=0.104X-0.622,R2=0.977,擬合結(jié)果相關(guān)性高。Katalinic等[15]通過對(duì)克羅地亞當(dāng)?shù)厮幍曩?gòu)買70種藥用植物的總酚含量和FRAP(μmol/L)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)的總酚含量和鐵離子還原量具有顯著的相關(guān)性,且擬合曲線r>0.95;值得一提的是,黑莓葉片和紅樹莓葉片的總酚含量分別排在第四和第九位,均屬于高總酚組和高FRAP組,這些結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相似。另外,從種屬的角度分析,除了山茶科山茶屬的茶葉制品基于高多酚含量表現(xiàn)出高的抗氧化活性外,薔薇科懸鉤子屬的紅樹莓和黑莓具有次高多酚含量和抗氧化活性,其他種屬植物作為植物多酚來源的優(yōu)勢(shì)不足。

2.2.2 總酚與自由基清除能力相關(guān)性分析

各植物材料的提取液自由基清除率經(jīng)由DPPH法和ABTS法測(cè)得。總酚與自由基清除能力相關(guān)性分析如表2所示,總酚含量與自由基清除率(%)顯著相關(guān)(P<0.01),但其相關(guān)因子分別為r=0.738和r=0.769,明顯低于總酚與FRAP的相關(guān)性。這可能與總酚的測(cè)定主要依賴福林酚顯色法,與FRAP的鐵離子還原法機(jī)制類似,兩者均為多酚化合物還原金屬離子顯色法。

多酚類化合物清除自由基的DPPH法和ABTS法,由于自由基本身不穩(wěn)定,而容易受到如溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間、溶劑、電離電勢(shì)等[24]多重因素的影響。例如:有機(jī)酸通過影響提取液的pH來影響自由基清除能力,pH對(duì)多酚類化合物清除自由基能力有很大的影響,隨pH增加多酚電離出多酚陰離子[24],多酚陰離子清除自由基的機(jī)制為單電子轉(zhuǎn)移(single electron transfer,SET),比多酚更容易給出電子[25]。其次,有機(jī)酸會(huì)與多酚類化合物具有協(xié)同清除自由基作用,反式烏頭酸、檸檬酸等有機(jī)酸的加入會(huì)增強(qiáng)多酚類化合物清除DPPH·的能力[20]。自由基加合物的生成使得某些還原能力不強(qiáng)的化合物在測(cè)定值上反而反映出更高的自由基清除能力,Tai等[26]發(fā)現(xiàn)-分子熊果苷基于氫原子轉(zhuǎn)移(hydrogen-atom transfer,HAT)機(jī)制消除-分子ABTS·+之后,反應(yīng)產(chǎn)物又以自由基加合物(radical adduct formation,RAF)機(jī)制清除了兩分子的ABTS·+;同樣的,抗壞血酸-2-O-葡萄糖苷與DPPH·生成加合物,使得其自由基清除能力遠(yuǎn)優(yōu)于比其抗氧化能力強(qiáng)的抗壞血酸[27]。自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的復(fù)雜性,導(dǎo)致多酚類化合物與DPPH·和ABTS·+的反應(yīng)產(chǎn)物多種多樣[28]。而我們的醇提混合物中并沒有考慮到各個(gè)植物材料之間的有機(jī)酸、 pH值和其他差異。因此,總酚與DPPH·和ABTS·+的清除率的相關(guān)性略遜于總酚含量和FRAP之間的相關(guān)性,但是總體上自由基清除率隨總酚含量增加而增加。

2.3 總酚與總黃酮含量相關(guān)性分析

黃酮類化合物屬于多酚類化合物的一個(gè)分支,原則上總黃酮與總酚含量應(yīng)該正相關(guān),顯著性分析結(jié)果顯示P<0.05,存在相關(guān)性,但是相關(guān)因子,r=0.545(如表2)。如表1所示,杠板歸、葡萄籽、秦皮和黨參等都出現(xiàn)高黃酮低總酚的情況,原因可能是總酚含量的測(cè)定利用SET機(jī)制[29],以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品,樣品的總酚含量不僅與酚類物質(zhì)濃度有關(guān),還與酚類物質(zhì)的給電子能力有直接關(guān)系[27]。而總黃酮含量的測(cè)定則利用絡(luò)合顯色機(jī)制,以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品,根據(jù)鋁鹽顯色法的顯色機(jī)制,該體系僅對(duì)具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的化合物在510 nm處有較強(qiáng)的吸收峰[30]。分別以蘆丁、山柰酚、原花青素、木犀草苷和芹菜素五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品采用鋁鹽顯色法單獨(dú)顯色后,并對(duì)其進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn),不具有鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物山柰酚和芹菜素(如圖2a-b)在510 nm左右不具有吸收峰;具有典型鄰苯二酚結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物雖然在510 nm處有吸收峰,但吸收峰高不同,依次為木犀草苷<原花青素<蘆丁(如圖2c-e)。不具有黃酮類化合物的基本結(jié)構(gòu)的原兒茶酸也可在該體系中顯色,且具有強(qiáng)吸收峰。鑒于以上三種情況,總黃酮的鋁鹽法測(cè)定結(jié)果受化合物結(jié)構(gòu)影響較大,因此與總酚含量有相關(guān)性,但擬合效果不好。

a-山柰酚;b-芹菜素;c-木犀草苷;d-原花青素;e-蘆丁圖2 5種黃酮鋁鹽顯色后全波長(zhǎng)掃描圖a-Kaempferol;b-Apigenin;c-Luteolin 7-O-β-D-glucoside;d-Proanthocyanidins;e-RutinFig.2 Full-wavelength scan of 5 kinds of flavonoid by aluminum salt method

總黃酮含量與總抗氧化能力(FRAP)顯著相關(guān)(P<0.05),但相關(guān)因子較低,r=0.493。原因可能為,黃酮類化合物受pH影響較大,對(duì)多酚氧化酶較為敏感,容易被降解失去活性[24]。堿性條件下黃酮類化合物會(huì)分解為小分子酚酸等多酚類化合物,而酚酸類化合物的抗氧化活性較黃酮類化合物會(huì)有明顯的減弱[31]。同時(shí)本試驗(yàn)受測(cè)定方法的限制,使得一些具有抗氧化活性的黃酮類化合物不能被檢測(cè)到,例如山柰酚具有很強(qiáng)的抗氧化活性,但山柰酚在鋁鹽顯色法中沒有吸收峰,而銀杏葉中的主要多酚類物質(zhì)為山柰酚[9]。因此,總黃酮含量與抗氧化活性的相關(guān)性還與植物材料中含有的黃酮類化合物的種類有很大關(guān)系,影響了其二者的相關(guān)性。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)對(duì)54種植物材料總酚和總黃酮含量、總抗氧化能力、DPPH·和ABTS·+清除能力進(jìn)行測(cè)定和相關(guān)性分析。以總酚含量為基礎(chǔ)將被試材料分為5組,A、B兩組植物材料總酚含量均高于100 mg/g,具有很強(qiáng)的抗氧化能力;基于相似的測(cè)定機(jī)制總酚含量與總抗氧化能力(FRAP)顯著相關(guān),線性擬合度高,r=0.987;但是由于自由基自身性質(zhì)、pH、顯色機(jī)制等因素,總酚與自由基清除能力和總黃酮含量有相關(guān)性,但擬合度低。盡管如此,高總酚含量仍對(duì)應(yīng)高抗氧化性。本試驗(yàn)為各植物材料進(jìn)一步的研究與應(yīng)用打下基礎(chǔ),薔薇科植物黑莓葉片、紅樹莓葉片和胡桃科核桃種皮均為農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的副產(chǎn)物,可以作為變廢為寶的潛在植物多酚提取原料,為我國(guó)十三五計(jì)劃的建設(shè)“健康中國(guó)”服務(wù)。