陳馨，張薇，張偉杰，趙怡欣，吳鴻雁，姚永忠

作為一種高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，乳腺癌在我國的發(fā)生率和病死率逐年上升，發(fā)病率在(50～60)/10萬，且其發(fā)病率與年齡成正相關(guān)，其早期檢出率低，往往到中晚期才被發(fā)現(xiàn)[1-2]。隨著醫(yī)療水平的綜合發(fā)展，盡管該病已得到較好的治療及預(yù)后，但局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移甚至死亡的患者仍較多。文獻(xiàn)報(bào)道腫瘤轉(zhuǎn)移是引起乳腺癌患者死亡的主要原因[3]，而腫瘤微環(huán)境在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著極其重要的作用，免疫細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境重要組成部分，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophages，TAMs)作為免疫細(xì)胞代表，與腫瘤細(xì)胞相互作用，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[4]。巨噬細(xì)胞分為2種類型，其中經(jīng)典活化巨噬細(xì)胞稱之為M1巨噬細(xì)胞，主要分泌促炎介質(zhì)，介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答;替代性活化細(xì)胞稱之為M2巨噬細(xì)胞，主要分泌抗炎介質(zhì)，介導(dǎo)Th2型免疫應(yīng)答[5]。研究表明,CD163特異性表達(dá)于M2型巨噬細(xì)胞[6]。文獻(xiàn)報(bào)道,在直腸癌、平滑肌肉瘤中CD163巨噬細(xì)胞浸潤密度與患者預(yù)后密切相關(guān)，且可作為疾病發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移的預(yù)測指標(biāo)[7-8]，而CD163在乳腺癌中的作用機(jī)制尚存在爭議，因此本研究采用免疫組織化學(xué)檢測CD163在乳腺癌組織中的表達(dá)，并分析其與臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系，同時(shí)干擾乳腺癌細(xì)胞中CD163的表達(dá)，觀察乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲及凋亡周期的變化，旨在為乳腺癌的防治和預(yù)后評估提供新的思路，報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2010年1月—2012年12月于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院普外科行乳腺外科手術(shù)切除的乳腺癌組織及其癌旁(距癌組織≥5 cm)正常組織標(biāo)本各160份，所有入選患者在術(shù)前均未進(jìn)行放化療和其他治療，且6年隨訪資料完整。160例患者，年齡25～83(48.32±12.23)歲；所有組織標(biāo)本均在4%中性福爾馬林液中固定，然后常規(guī)取材石蠟包埋，用于后續(xù)免疫組織化學(xué)法檢測。

1.2 材料和試劑 乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、巨噬細(xì)胞MH-S采購自美國ATCC公司，熒光標(biāo)記的2'-O-甲基 siRNA CD163-FAM、穩(wěn)定陰性對照siRNA CD163-NC和CD163、GAPDH 引物購自上海吉瑪生物技術(shù)有限公司。兔抗人CD163單克隆抗體采購自上海長島生物技術(shù)有限公司，辣根過氧化物標(biāo)記的羊抗兔IgG購自上海滬峰化工有限公司，鏈霉抗生物素蛋白—過氧化物酶(SP)試劑盒購自美國Abcam公司，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢測指標(biāo)與方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)檢測CD163蛋白表達(dá)：將石蠟包埋的組織標(biāo)本切成5 μm厚度的切片，放入40%酒精中，40℃水浴處理4 min，展開后置于60℃烘箱中進(jìn)行烘片。采用二甲苯進(jìn)行脫蠟20 min，然后梯度酒精進(jìn)行水化，然后加入3%H2O2，室溫10 min，從而阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性，再對CD163蛋白進(jìn)行高溫高壓組織修復(fù)，PBS進(jìn)行沖洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封閉液，加入一抗，置于4℃冰箱過夜，PBS代替一抗作為陰性對照，次日取出使用PBS沖洗，每張切片滴加二抗，室溫下孵育30 min，PBS沖洗5次，每次3 min，加入DAB顯色水使用PBS沖洗終止顯色，沖洗10 min，鹽酸酒精分化后，梯度酒精脫水干燥，光鏡下觀察組織標(biāo)本。

1.3.2 CD163蛋白表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)及分組：CD163的陽性表達(dá)位于細(xì)胞膜，少量表達(dá)于胞質(zhì)和細(xì)胞外間質(zhì)中，光學(xué)顯微鏡下觀察制備好的切片，陽性表達(dá)為細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色、棕黃色或黃褐色顆粒。采用雙盲法由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行評估，每張切片先在低倍鏡下(×100)確定3個(gè)陽性染色高密度區(qū)及熱點(diǎn)區(qū)，然后隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野(×400)在光鏡下觀察計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)，取平均數(shù)作為密度計(jì)數(shù)結(jié)果。依據(jù)染色結(jié)果，根據(jù)cut-off值選中位數(shù)作為低表達(dá)和高表達(dá)的決斷點(diǎn)[9]。其中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)>28個(gè)/400倍鏡定為高表達(dá)，≤28個(gè)/400倍鏡為低表達(dá)。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)：乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、巨噬細(xì)胞MH-S于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，然后調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個(gè)細(xì)胞/平皿接種于25 ml培養(yǎng)皿中，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，濕度95%。

1.3.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將生長良好的巨噬細(xì)胞MH-S消化后加含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基，均勻鋪至6孔板中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞融合度達(dá)70%左右時(shí)換為無血清培養(yǎng)基待轉(zhuǎn)染用。采用Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑并參照說明書，分別將陽性質(zhì)粒siRNA CD163-FAM和陰性對照siRNA CD163-NC轉(zhuǎn)染至MH-S細(xì)胞，48 h后用Western-blot法檢測CD163的表達(dá)效率。并設(shè)立無轉(zhuǎn)染的MH-S細(xì)胞為空白對照組(control)。

1.3.5 Western-blot法檢測CD163的表達(dá)：提取各自細(xì)胞中總蛋白，并用BCA蛋白定量試劑盒測定含量。制備蛋白樣品，配制SDS-PAGE凝膠，電泳后轉(zhuǎn)PVDF模，加含5%BSA的封閉液室溫下孵育2 h。分別加適量用封閉液稀釋的CD163一抗，4℃冰箱過夜孵育。次日復(fù)溫后用PBST將PVDF膜洗滌干凈，分別加適量稀釋好的HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，室溫作用2 h，PBST洗滌后加ECL避光5 min，暗室曝光并拍照，同時(shí)以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

1.3.6 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲：用無血清RPMI1640培養(yǎng)基按1∶5稀釋基質(zhì)膠Matrigel，并向每個(gè)Transwell小室中加50 μl，37℃靜置2 h凝固后備用。取對數(shù)期的MCF-7和MH-S細(xì)胞，然后按照10∶1的比例，調(diào)整細(xì)胞密度為5×105/ml，取250 μl細(xì)胞懸液至Transwell小室中，600 μl含10%胎牛血清的RPMI1640加至下室，并保證下層完全培養(yǎng)基與Transwell小室間無氣泡產(chǎn)生。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后將Transwell小室取出，棄培養(yǎng)液加PBS洗滌，4%多聚甲醛固定下室面，PBS洗滌，加0.1%結(jié)晶紫染液室溫避光染色15 min，用棉簽輕輕擦掉小室上層未遷移細(xì)胞，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下取5個(gè)高倍視野觀察拍照，并計(jì)數(shù)穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，每組取平均數(shù)。

1.3.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖：取對數(shù)期的MCF-7和MH-S細(xì)胞，然后按照10∶1的比例，以50%匯合率接種于6孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，濕度95%，培養(yǎng)2周，將培養(yǎng)液棄去，PBS洗滌，加入1 ml甲醇固定10 min，棄去固定液，結(jié)晶紫染色，晾干后計(jì)數(shù)。

1.3.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：取對數(shù)期的MCF-7和MH-S細(xì)胞，然后按照10∶1的比例，以50%匯合率接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，濕度95%，培養(yǎng)24 h后， 離心棄上清，重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)，然后取195 μl Annexin V-FITC緩沖液重懸細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC，混勻，加入10 μl 碘化丙啶(PI)染色液，混勻。同時(shí)，設(shè)置Annexin V-FITC和碘化丙啶單染為對照管。室溫下，避光孵育15 min，孵育過程中重懸細(xì)胞2次，隨后置于冰浴中。流式細(xì)胞儀檢測DNA合成前期(G1)、DNA合成期(S)與DNA合成后期(G2)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中CD163+巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量比較 乳腺癌組織中CD163+巨噬細(xì)胞浸潤數(shù)量為(52.39±3.24)，明顯高于癌旁正常組織(13.25±1.76)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=134.273,P<0.001)。

學(xué)生對這兩門課學(xué)習(xí)缺乏主動性。因?yàn)檫@兩門課程聯(lián)系實(shí)際應(yīng)用很難，由于課程本身就具有理論強(qiáng)，與實(shí)踐聯(lián)系困難，特別是《信號與系統(tǒng)》課程研究的是連續(xù)時(shí)間信號，與實(shí)際嚴(yán)重脫軌，相對來說《數(shù)字信號處理》中還提到的有限長和無限長數(shù)字濾波器設(shè)計(jì)的方法和基本應(yīng)用，所以大部分本科生在學(xué)習(xí)這門信號處理課程中，反應(yīng)難點(diǎn)大，不愛學(xué)，學(xué)習(xí)缺乏主動性，存在及格就行的不良思想，尤其有產(chǎn)生對未來就業(yè)和考研毫無用處的錯(cuò)誤思想。同時(shí)再學(xué)課程之前沒有復(fù)習(xí)相關(guān)數(shù)學(xué)，對課程中的表達(dá)式就不理解和分析，學(xué)生不會，就會導(dǎo)致興趣缺乏和沒有主動性，這樣就形成了惡性循環(huán)，課程掌握的難度就越來越大和越難了。

2.2 CD163+巨噬細(xì)胞與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 CD163+巨噬細(xì)胞在不同年齡及腫瘤直徑中的浸潤數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，而在不同分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)， 見表1。

表1 CD163+巨噬細(xì)胞與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 [例(%)]

2.3 轉(zhuǎn)染后各組MH-S中CD163蛋白表達(dá)比較 siRNA-FAM亞組CD163明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.164,P<0.01)，提示成功構(gòu)建了CD163低表達(dá)的MH-S巨噬細(xì)胞。見圖1。

2.4 巨噬細(xì)胞中CD163對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖能力的影響 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-FAM亞組細(xì)胞克隆形成數(shù)明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.960,P<0.01)，見圖2。

2.5 巨噬細(xì)胞中CD163對乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-FAM亞組細(xì)胞侵襲能力明顯低于siRNA-NC亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.397，P<0.05)，見圖3。

2.6 巨噬細(xì)胞中CD163對乳腺癌MCF-7細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與siRNA-NC組相比，siRNA-FAM組G1期MCF-7 細(xì)胞所占的比例明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.398，P<0.01)，而 G2 期細(xì)胞所占的比例明顯低于siRNA-NC組，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.542，P<0.01)，見圖4。

3 討 論

乳腺癌作為臨床常見腫瘤，是引起女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，文獻(xiàn)報(bào)道[10]，腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中會伴隨炎性細(xì)胞浸潤，而巨噬細(xì)胞是主要的炎性細(xì)胞，其作為機(jī)體固有免疫反應(yīng)重要組成成分，在不同組織微環(huán)境中可分化為不同亞型，從而發(fā)揮不同的生物學(xué)作用，研究發(fā)現(xiàn)口腔癌、食管癌等惡性腫瘤組織中高水平的巨噬細(xì)胞患者預(yù)后往往較差[11-12]，因此近年來腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞浸潤成為醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。

圖3巨噬細(xì)胞中CD163對乳腺癌細(xì)胞MCF-7侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×400)

綜上所述，乳腺癌組織中CD163+巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯升高，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度密切相關(guān)，且CD163能夠增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲能力，可為臨床評估乳腺癌患者預(yù)后提供依據(jù)。

利益沖突：無

作者貢獻(xiàn)聲明

陳馨、姚永忠：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過程，論文撰寫，提出研究思路，分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；張薇、張偉杰、趙怡欣、吳鴻雁：實(shí)施研究過程，資料收集整理