郝娜,田蕓婕,賈亞靜,路曉琳
子宮內膜異位癥(endometriosis,EMs)多發(fā)于育齡期婦女,由多因素、多遺傳基因作用導致具有活性的子宮內膜組織異位,生長在子宮腔以外并反復周期性出血,從而引起患者慢性盆腔痛、痛經、不孕等[1-2]。近年來,隨著社會快速發(fā)展,生活節(jié)奏加快,臨床上EMs發(fā)病率呈逐年升高的趨勢,成為臨床上常見且危害較大的一類婦科疾病,嚴重影響婦女的生活質量、生育功能和身心健康[3]。目前EMs的發(fā)病機制尚未得到明確闡明,臨床上也缺乏治療EMs的特效藥,因此探究與EMs發(fā)生發(fā)展相關基因,以期找尋預防、診斷和治療EMs的新靶點對EMs患者意義重大。雌激素受體β(estrogen receptorβ,ERβ)作為可溶性糖蛋白分子在轉錄水平上調節(jié)基因表達,雌激素在機體內發(fā)揮生理功能必須通過ERβ介導[4-5]。EMs受雌激素調控,因此ERβ基因的變化可能影響雌激素的生理作用,從而導致EMs發(fā)病[6]。ERβ基因在EMs患者血清中表達水平未見相關研究,因此本研究使用聚合酶鏈反應—限制性內切酶片段長度多態(tài)性方法檢測EMs患者血清中ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸多態(tài)性,分析rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床病理特征的關系,報道如下。
1.1 臨床資料 選取于2017年6月—2019年6月邯鄲市中心醫(yī)院、河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院婦科收治的60例EMs患者作為研究對象(EMs組),依據(jù)2015年“子宮內膜異位癥的診治指南”[7],超聲影像為無回聲區(qū)內有密集光,腹腔鏡檢觀察病變形態(tài),經病理檢查確診。EMs組年齡21 ~51(35.23±3.48)歲,體質量指數(shù)(22.94±3.19)kg/m2;根據(jù)美國生育協(xié)會在1997年修訂的EMs分期(R-AFS)[8],Ⅰ期8例,Ⅱ期12例,Ⅲ期19例,Ⅳ期21例;病理類型,卵巢型21例,腹膜型20例,混合型19例;痛經情況,無或輕度痛經29例,中或重度痛經31例;產次,0次11例,1次34例,≥2次15例;有流產史33例;有不孕史19例。另選取同期來邯鄲市中心醫(yī)院體檢的健康女性67例作為對照組,年齡22~52(36.17±2.91)歲,體質量指數(shù)(22.74±4.50)kg/m2;產次,0次13例,1次36例,≥2次18例;有流產史36例;有不孕史20例。2組受試者年齡、體質量指數(shù)、孕產情況比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準通過,符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》,入選者知情同意并簽署知情同意書。
1.2 納入、排除標準 納入標準:(1)月經周期正常;(2)6個月內未曾使用激素類藥物。排除標準:(1)患有其他婦科腫瘤或婦科病的者;(2)伴有心、腎、肝功能不全者;(3)免疫功能缺陷者;(4)處于妊娠期的受試者。
1.3 主要試劑和儀器 rs1256064和rs1256049引物序列由上海生物工程公司合成;DNA提取試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司;SimpliAmp PCR儀購自美國賽飛世爾科技有限公司。
1.4 檢測方法 清晨取所有受試者空腹靜脈血6 ml,用肝素抗凝,隨后置于-20℃冰箱中待用。
1.4.1 用DNA提取試劑盒提取基因: rs1256064位點上游引物序列5’-TGATTGCTCAGCACATAGCC-3’,下游引物序列5’-GACAGGTCTTCAGCACCACA-3’;rs1256049位點上游引物序列5’-TCTACACACACAGGGAGCTGA-3’,下游引物序列5’-CAGGACTTTGTTCCCACTCAC -3’;PCR擴增體系共20.0 μl,其中上下游引物(5μmol)各2.0 μl,ddH2O 4.0 μl,SYBR Mix 10.0 μl,cDNA(25 ng/ml) 2.0 μl。PCR反應條件:95℃ 5min,(95℃變性45s,60℃延伸60s)×40,72℃ 10min。
1.4.2 酶切PCR擴增引物: rs1256064和rs1256049位點的PCR產物經RsaⅠ限制性內切酶進行酶切,酶切體系共20.0 μl,其中PCR擴增產物16 μl,10×Buffer 2.1 μl,RsaI 0.7 μl,BSA 0.2 μl。酶切反應條件為37℃ 4 h。將酶切后的產物經凝膠電泳分析,凝膠成像儀成像,隨后根據(jù)酶切產物片段的大小確定基因型。
2.1 2組rs1256064位點基因型和等位基因頻率比較 經PCR擴增出rs1256064位點基因318 bp片段,經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生153 bp和165 bp 2個片段,在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對照組相比,EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)顯著升高,PP基因型數(shù)顯著降低(P<0.01),p等位基因頻率顯著升高,P等位基因頻率顯著降低(P<0.01),見表1。
2.2 2組rs1256049位點基因型和等位基因頻率比較 經PCR擴增出rs1256049位點基因299 bp片段,經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生105 bp和172 bp 2個片段,在群體中組成pp、Pp和PP 3種不同類型的基因型。與對照組相比,EMs患者組rs1256049等位基因PP基因型數(shù)顯著升高,Pp基因型數(shù)顯著降低(P<0.05),P等位基因頻率顯著升高,p等位基因頻率顯著降低(P<0.05), 見表2。
2.3 rs1256064、rs1256049位點基因與子宮內膜異位癥臨床病理特征的關系 rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無流產、有無不孕史有關(P<0.05),與EMs患者年齡、病理類型、有無痛經、產次無關(P>0.05), 見表3。
2.4 影響子宮內膜異位癥發(fā)病的多因素Logistic回歸分析 多因素Logistic回歸分析表明,臨床分期、不孕史、rs1256064位點p等位基因頻率升高、rs1256049位點P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險因素(P<0.05),見表4。
表1 2組rs1256064位點基因型和等位基因頻率比較
表2 2組rs1256049位點基因型和等位基因頻率比較
表3 rs1256064和rs1256049位點與子宮內膜異位癥臨床病理特征的關系 [例(%)]
表4 影響EMs發(fā)病的多因素Logistic回歸分析
EMs因侵襲性強、復發(fā)率高成為臨床上婦科難治疾病,育齡期婦女發(fā)病率高達10%,成為婦女不孕癥的危險因素[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn),不孕癥婦女患者中25%~50%伴有EMs,盆腔體檢正常的育齡女性超過50%患有不同程度的EMs。到目前為止,很多學者對EMs的發(fā)病機制開展大量的臨床研究和基礎實驗,但仍無法完全闡述EMs的具體發(fā)病機制[11-12]。學術界對免疫學、子宮內膜種植、遺傳學發(fā)病機制頗有爭論,隨著生物學研究的不斷發(fā)展,ERβ基因與EMs發(fā)生發(fā)展的關系受到重視,成為研究的熱點[13]。但大多從細胞或動物模型上探討ERβ與EMs的關系,在臨床上未曾對ERβ基因具體核苷酸位點進行研究。因此本研究選ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸,試圖從基因水平上找尋ERβ基因rs1256064和rs1256049位點單核苷酸多態(tài)性與EMs發(fā)病之間的相關性。
ERβ基因由40 kb堿基組成,位于14q23-24.1,包含8個外顯子和7個內含子,廣泛分布在兩性組織和生殖器官中,在人乳腺、卵巢、子宮內膜中表達,且分泌期低表達,增生期高表達[14-15]。研究發(fā)現(xiàn),ERβ可能與子宮內膜癌、子宮內膜異位癥相關[16]。李鵬程等[17]研究發(fā)現(xiàn),ERβ在EMs大鼠模型子宮內膜中高表達,可上調血管內皮生長因子(VEGF)、氨基末端激酶(c-Jun)表達水平,在EMs發(fā)展中發(fā)揮重要作用。在廣西壯族絕經婦女血清雌二醇、孕酮水平研究中,ERβ基因經Rsa-Ⅰ內切酶酶切出RR、Rr、rr、r、R基因組,r基因組孕酮和雌二醇水平顯著降低,黃體生成素、促卵泡激素顯著升高[18]。本研究發(fā)現(xiàn),經PCR擴增出rs1256064位點基因318 bp片段,經RsaⅠ限制性內切酶酶切后分別產生153 bp、165 bp 2個片段,與對照組相比,EMs組患者rs1256064等位基因pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著升高,PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著降低,提示rs1256064位點基因與EMs相關。對rs1256049等位基因研究發(fā)現(xiàn),經PCR擴增出rs1256049位點基因299 bp片段,經RsaⅠ限制性內切酶酶切后產生105 bp和172 bp 2個片段,與對照組相比,EMs組患者rs1256049等位基因PP基因型數(shù)和P等位基因頻率顯著升高,Pp基因型數(shù)和p等位基因頻率顯著降低,提示rs1256049位點基因與EMs有關,可能此類基因特征患者更易患EMs。臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn),rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率與EMs患者臨床分期、有無流產、有無不孕史有關,與EMs患者年齡、病理類型、有無痛經、產次無關,提示rs1256064和rs1256049位點等位基因頻率可能參與EMs進程,與EMs發(fā)生發(fā)展相關,多因素Logistic回歸分析表明,臨床分期、不孕史、rs1256064位點p等位基因頻率升高、rs1256049位點P等位基因頻率升高是EMs發(fā)病的危險因素,提示該類患者具有患EMs風險,應定期體檢,注意防治。
綜上所述,EMs患者rs1256064位點基因pp基因數(shù)和p等位基因頻率、rs1256049位點基因PP基因數(shù)和P等位基因頻率顯著升高,與患者臨床分期、不孕史有關,是EMs患病的危險因素,提示rs1256064和rs1256049位點可能作為早期預防和判斷EMs的臨床指標。但rs1256064和rs1256049位點基因具體作用機制還有待從動物和細胞模型進行深入研究。
利益沖突:所有作者聲明無利益沖突
作者貢獻聲明
郝娜:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;田蕓婕:提出研究思路,分析試驗數(shù)據(jù),論文審核;賈亞靜:實施研究過程,資料搜集整理,論文修改;路曉琳:進行統(tǒng)計學分析