郭良煜 陶春杰 陳敬騰 龔長(zhǎng)天 施玉博 郭衛(wèi)春

骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤，好發(fā)于兒童和青少年，主要發(fā)生于長(zhǎng)骨遠(yuǎn)端并且容易產(chǎn)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲。目前針對(duì)骨肉瘤治療的金標(biāo)準(zhǔn)是新輔助化療加手術(shù)切除，這使得骨肉瘤的5年生存率從20%提高到了60%[1]。然而，化療藥物的毒性和骨肉瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物表現(xiàn)出的耐藥性對(duì)骨肉瘤的臨床治療和長(zhǎng)期存活率構(gòu)成了極大挑戰(zhàn)。近幾年的研究表明誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡是消滅癌細(xì)胞的關(guān)鍵因素[2～4]。

吲哚美辛是NSAID一類(lèi)的抗炎藥物，主要用于類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎等相關(guān)疼痛的對(duì)癥治療[5]。近年來(lái)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道吲哚美辛可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移[6,7]同時(shí)也可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡[8～11]。然而，吲哚美辛對(duì)人類(lèi)OS的作用仍有待于進(jìn)一步研究。本研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞形態(tài)和凋亡的影響，并初步探討吲哚美辛抗骨肉瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為吲哚美辛應(yīng)用于臨床骨肉瘤患者的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料:人骨肉瘤143B細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center For Type Culture Collection, CCTCC)；MEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；1%雙抗(青霉素100U/ml, 鏈霉素100μg/ml)購(gòu)自吉諾公司;含EDTA的胰酶購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司；吲哚美辛、DMSO以及胰蛋白酶均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；Cell Counting Kit-8 (CCK-8)購(gòu)自日本同仁化學(xué)研究所；Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；一抗 caspase-3、caspase-9、GAPDH、Bcl-2以及Bax均購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記抗兔IgG二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：人骨肉瘤143B細(xì)胞用含10%的胎牛血清和1%雙抗的MEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng), 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.細(xì)胞增殖能力檢測(cè)：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個(gè)/毫升濃度接種于96孔板上。每孔加入100μl,過(guò)夜孵育待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的吲哚美辛，陰性對(duì)照組加入等體積的MEM培養(yǎng)基。分別培養(yǎng)24、48、72h后每孔加入10μl的CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2h后用酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecan Sunrise公司)測(cè)量450nm波長(zhǎng)下的吸光度(A)值。A值與細(xì)胞活力和數(shù)量呈正比，所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次。

4.形態(tài)學(xué)觀察：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個(gè)/毫升濃度接種于6孔板中。24h后分別加入不同濃度的吲哚美辛(0、400、600、800μmol/L)隨后置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后, 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況和生長(zhǎng)情況，并拍照。

5.細(xì)胞凋亡檢測(cè)：將骨肉瘤143B細(xì)胞以1×105個(gè)/毫升濃度接種于6孔板中。用不同濃度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后，用胰酶消化細(xì)胞，離心5min后用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次后用 250μl binding buffer重懸細(xì)胞，取100μl細(xì)胞懸液于5ml流式管中，加入5μl的Annexin V/FITC和5μl的PI，混勻后避光孵育30min，最后再加入400μl binding buffer，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

6.Transwell遷移實(shí)驗(yàn):將小室放入24孔板中，隨后將骨肉瘤143B細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于小室的上室中。下室加入含20%血清的MEM培養(yǎng)基以建立血清濃度差。后用不同濃度的吲哚美辛(0、600、800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞。處理24h后用PBS清洗15min，用甲醇固定15min，吉姆薩染色10min。隨后用棉簽擦去上室的細(xì)胞，用倒置顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

7.Western blot法：將骨肉瘤143B細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中。用吲哚美辛(800μmol/L)處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后用PBS洗滌2次，隨后加入RIPA裂解液提取總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度后用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，轉(zhuǎn)膜后用 5%的脫脂奶粉于室溫封閉1h，后加入相應(yīng)一抗隨后在4℃條件下過(guò)夜孵育。后用HRP標(biāo)記抗兔IgG于室溫孵育2h。TBST溶液洗 5×10min，隨后用ECL發(fā)光液顯色后分析結(jié)果以目的蛋白與GAPDH的灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.吲哚美辛抑制骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響:用不同的濃度分別處理143B細(xì)胞24和48h后用CCK8檢測(cè)增殖能力(圖1)。隨著吲哚美辛濃度的增加，細(xì)胞活力在不斷下降。同時(shí)相同濃度下的48h細(xì)胞活力均小于24h細(xì)胞活力，證明吲哚美辛可以抑制143B細(xì)胞的增殖，并且具有時(shí)間-劑量依賴(lài)性。

圖1 吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞增殖的影響與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

2.吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞形態(tài)的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理骨肉瘤143B細(xì)胞24h后，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)顯示對(duì)照組細(xì)胞均貼壁同時(shí)生長(zhǎng)良好，形態(tài)正常，排列規(guī)則且細(xì)胞密度高；而實(shí)驗(yàn)組中，細(xì)胞形態(tài)異常同時(shí)細(xì)胞皺縮且排列紊亂，并且隨著吲哚美辛濃度的增加，細(xì)胞數(shù)量及密度明顯減少(圖2)。

圖2 吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞形態(tài)的影響(×100)A.對(duì)照組;B.400μmol/L吲哚美辛處理組;C.600μmol/L吲哚美辛處理組;D.800μmol/L吲哚美辛處理組

3.吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理143B細(xì)胞后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞總凋亡率詳見(jiàn)圖3?？偟蛲雎?%)=早期凋亡率+晚期凋亡率。隨著吲哚美辛濃度的提高，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的凋亡率不斷增高。

4.吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞遷移的影響:用不同濃度的吲哚美辛處理143B細(xì)胞后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞總數(shù)小于對(duì)照組細(xì)胞總數(shù)(圖4)，并且隨著吲哚美辛濃度的提高，實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞總數(shù)不斷減少。

圖3 吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡的影響與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

圖4 吲哚美辛對(duì)骨肉瘤143B細(xì)胞遷移的影響(結(jié)晶紫，×100)與對(duì)照組比較,*P<0.05,**P<0.01

5.吲哚美辛對(duì)凋亡蛋白的影響:為了探討吲哚美辛誘導(dǎo)143B細(xì)胞的凋亡機(jī)制，檢測(cè)143B處理后的Bcl-2的表達(dá)情況(圖5)，與對(duì)照組比較，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，證明吲哚美辛通過(guò)下調(diào)Bcl-2凋亡蛋白來(lái)誘導(dǎo)143B細(xì)胞的凋亡。

圖5 吲哚美辛對(duì)凋亡蛋白的影響與對(duì)照組比較,*P<0.05

討 論

骨肉瘤是骨科中常見(jiàn)的原發(fā)性骨腫瘤，具有容易復(fù)發(fā)和侵襲性強(qiáng)的特點(diǎn)。而傳統(tǒng)的化療因其毒性不良反應(yīng)并且骨肉瘤容易產(chǎn)生耐藥性的原理使得骨肉瘤的臨床治療效果無(wú)明顯提高。而之前的研究中顯示抗炎藥物，例如賽來(lái)西布，可以抑制腫瘤細(xì)胞和血管生成、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移等[12，13]。同時(shí)吲哚美辛對(duì)胃癌、乳腺癌等惡性腫瘤有顯著作用[14]。有研究證實(shí)了吲哚美辛可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖和分化，同時(shí)通過(guò)調(diào)控細(xì)胞中的溶酶體從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并且吲哚美辛也可以抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲，并且與基于葡聚糖的化合物相混合后可以降低乳腺癌細(xì)胞的耐藥性，其原理是減少了MDR相關(guān)蛋白所介導(dǎo)的化療藥物的排出[15，16]。

本研究通過(guò)不同濃度的吲哚美辛處理骨肉瘤143B細(xì)胞，結(jié)果顯示吲哚美辛可以抑制骨肉瘤143B細(xì)胞的增殖和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡，而無(wú)論是細(xì)胞增殖還是侵襲，都與凋亡是密不可分的。凋亡的經(jīng)典途徑有兩種：線粒體途徑和Fas配體途徑，兩者都具有共同的下游通路caspase家族[17]。對(duì)于線粒體途徑，在接受死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)后，Bcl -2影響電壓依賴(lài)性陰離子通道 (VDAC)從而導(dǎo)致細(xì)胞膜電位降低，通透性增加，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[18～20]。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示Bcl-2表達(dá)下調(diào)，證實(shí)了吲哚美辛通過(guò)下調(diào)Bcl-2來(lái)誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡。

綜上所述，吲哚美辛可以通過(guò)劑量依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性來(lái)抑制其骨肉瘤的增殖和遷移，同時(shí)通過(guò)下調(diào)Bcl-2來(lái)誘導(dǎo)骨肉瘤143B細(xì)胞凋亡。這為吲哚美辛治療骨肉瘤患者提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但與骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)的其他通路，例如Notch和Wnt通路等都未進(jìn)行研究，后續(xù)實(shí)驗(yàn)將會(huì)研究吲哚美辛與以上兩通路之間的聯(lián)系。