王文娜 李冬華 劉 宇 邱甜甜 韋 超

子宮肌瘤(uterine fibroids)是子宮中最常見的良性平滑肌腫瘤，主要由子宮平滑肌細(xì)胞增生而成，臨床表現(xiàn)可能包括月經(jīng)過多、痛經(jīng)、不孕、骨盆疼痛和骨盆壓迫癥狀等，還可能包括尿路疾病或便秘等[1,2]。有研究發(fā)現(xiàn)子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與患者體內(nèi)性激素水平紊亂、子宮肌瘤內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的過量積累、抗凋亡基因的過表達(dá)、遺傳基因的突變、免疫因子的調(diào)控等有關(guān)，年齡、體質(zhì)、飲食習(xí)慣等也為子宮肌瘤的高危因素[3～5]。在國外，首選的治療方法為手術(shù)切除，其次為使用米非司酮、避孕藥、醋酸烏利司他等藥物治療，釋放宮內(nèi)節(jié)育器對癥治療，以及作為保守治療的肌瘤動脈栓塞術(shù)和高頻超聲治療(HIFU)等，但是由于患者年齡、體質(zhì)、病情等因素的影響，上述各種方法均存在不足之處[6]。

近年來，中藥治療逐漸成為人們優(yōu)先選擇的一種治療方法，而且筆者發(fā)現(xiàn)有研究顯示腫瘤的發(fā)生與發(fā)展與Th1/Th2平衡的變化密切相關(guān)，正常情況下人體內(nèi)處于相對平衡狀態(tài)，而且這種平衡狀態(tài)時由這兩種細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子來調(diào)控，當(dāng)平衡向Th1漂移時則會引發(fā)抗腫瘤免疫機(jī)制[7]。因此本實(shí)驗(yàn)將通過異種移植造模法制備小鼠子宮肌瘤模型，用理沖湯及陽性藥物米非司酮進(jìn)行干預(yù)，采用HE染色觀測小鼠子宮平滑肌組織結(jié)構(gòu)變化，采用超敏多因子檢測法檢測各組小鼠血清中各免疫相關(guān)細(xì)胞因子的濃度變化，探討理沖湯通過調(diào)控Th1和Th2分泌的細(xì)胞因子來治療子宮肌瘤的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:CB-17 Scid雌性小鼠[購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK(京)2016-0001]，未孕，6～9周齡，體質(zhì)量19～21g，共24只。飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物房，飼養(yǎng)條件達(dá)到SPF級標(biāo)準(zhǔn)。

2.實(shí)驗(yàn)藥物:理沖湯出自《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》一書，組成為生黃芪9g、黨參6g、白術(shù)6g、生山藥15g、天花粉12g、知母12g、三棱9g、莪術(shù)9g、生雞內(nèi)金9g。上述中藥飲片購自北京同仁堂飲片有限責(zé)任公司。在參考并尊重原方使用方法的基礎(chǔ)上，按以下方法熬制：按上述處方量取中藥飲片，先后水提2次。第1次加藥材8倍量水浸泡0.5h，煎煮1h，煎至將成，加陳醋少許；第2次加藥材的6倍量水煎煮1h，煎至將成時加陳醋少許，合并煎液，過濾，減壓(60℃以下，真空度0.05kPa)濃縮成相對密度為1.20～1.30(60℃)的稠膏，加蒸餾水配制成含生藥1.7g/ml濃縮液，并對pH值、比重、衛(wèi)生學(xué)進(jìn)行檢測，低溫(0～4℃)保存，用前搖勻。

米非司酮(北京紫竹藥業(yè)有限公司，RU-486，批號：43110911，規(guī)格：25毫克/片)，用0.5%羧甲基纖維素(美國Sigma公司，C5678)配制成懸液，濃度為0.7g/L。

黃體酮注射液(上海通用公司，130905)；苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸公司，0703121)；堿性成纖維細(xì)胞生長因子(美國SAB公司，70402)；表皮生長因子(美國SAB公司，70504)。

3.主要試劑與儀器：MSD試劑盒(優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，K15048D-1)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，TH-200/OlympuS V-RFL-T)；MSD超敏因子電化學(xué)發(fā)光分析儀(美國MSD公司，QuickPlex SQ120)。

4.人子宮肌瘤細(xì)胞懸液的制備：準(zhǔn)備好眼科剪、鑷子等器材，高溫高壓消毒滅菌。操作時佩戴無菌手套，在無菌操作臺上操作，用鑷子取1cm3大小新鮮子宮肌瘤組織，剔掉血管和壞死部分，在含有青鏈霉素混合液的PBS中清洗3次，然后迅速將子宮組織移至置于冰板上的燒杯中，加入適量的DMED培養(yǎng)基，用眼科剪將組織迅速剪碎至均勻細(xì)小顆粒。用無菌吸管將DMEM液吸去后，將組織顆粒移至15ml離心管中，加入10ml 0.2%的Ⅰ型膠原酶進(jìn)行消化，輕輕搖晃使組織顆粒與消化酶均勻接觸，再將其放入37℃水浴鍋中消化30～90min(消化時間視組織消化情況而定)直到組織塊明顯減小或成乳糜狀即可；將離心管移出水浴鍋，加入20%完全培養(yǎng)基終止消化，無菌吸管吸取上清液，用70mm細(xì)胞篩進(jìn)行篩選，收集細(xì)胞濾液；12000r/min離心10min，用移液槍吸去上清液，然后加入完全培養(yǎng)基(DMEM、20%胎牛血清、1%青鏈霉素混合液)進(jìn)行重懸，將細(xì)胞懸液接種到25cm3培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；12～24h后對細(xì)胞進(jìn)行觀察，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行細(xì)胞換液，之后48h換液1次；當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%時，用0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，加入完全培養(yǎng)基，配制成密度為1.5×106個/毫升子宮肌瘤細(xì)胞懸液備用。

5.子宮肌瘤小鼠模型的制備：模型組、理沖湯組、陽性藥物組在接受異種移植之前，先腹腔注射苯甲酸雌二醇注射液(2mg/kg)2周，再腹腔注射黃體酮注射液(2.5mg/kg)1周，以促進(jìn)子宮發(fā)育，正常組注射等量0.9%氯化鈉注射液；小鼠稱重，戊巴比妥鈉(0.15ml/10g)對小鼠進(jìn)行麻醉，下腹部消毒備皮，橫切暴露腹腔，鈍性分離脂肪組織探查“Y”形子宮。提前在子宮肌瘤細(xì)胞懸液中加入伊文思藍(lán)以確保注射部位可視化，1ml無菌注射器吸取有100μl子宮肌瘤細(xì)胞懸液(細(xì)胞數(shù)約為1.5×106個)注射于小鼠子宮右側(cè)分角肌層，同時吸取10μl表皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞因子注射于子宮左側(cè)分角相同部位；用可吸收縫合線逐層縫合腹腔切口，并滴加適量青-鏈霉素預(yù)防感染，適當(dāng)對小鼠進(jìn)行保溫；定期觀察小鼠狀態(tài)，小鼠能夠進(jìn)行正常生理活動等后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

6.藥物干預(yù):提前將藥物在水浴鍋中加熱至30℃。理沖湯組每日灌服理沖湯濃縮液，用量為30.45g/kg(按照體表面積折算，用藥量為成人等效劑量的3倍)。陽性藥物組每日灌服米非司酮懸液，用藥量為2.9mg/kg(為成人的等效劑量)。正常組和模型組小鼠每日灌服等量0.9%氯化鈉注射液。連續(xù)灌服4周。

7.HE染色：光鏡下對各組小鼠子宮進(jìn)行肉眼觀察，然后取子宮分角以上0.2cm相同部位一段子宮組織，約5mm3大小，10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色，于光鏡(×200)下進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

8.MSD 超敏多因子電化學(xué)發(fā)光法：準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品：稀釋液45加1ml到標(biāo)準(zhǔn)品中，充分振蕩，室溫放置15～20min，作為最高的濃度點(diǎn)，依次做4倍稀釋，7個標(biāo)準(zhǔn)品+1個Blank；準(zhǔn)備檢測抗體稀釋液：吸取檢測抗體30μl，并用稀釋液45補(bǔ)足1.5ml體積。準(zhǔn)備清洗液：配置1×的PBS(0.05%吐溫-20)待用。準(zhǔn)備讀板液：配置2×的讀板液；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入50μl的樣本和標(biāo)準(zhǔn)品，并用封口膜封上，室溫振蕩2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入配置好的25μl檢測抗體，并用封口膜封上，室溫振蕩2h；清洗MSD板3次，每次150μl的清洗液；每孔加入150μl配置好的讀板液，上機(jī)檢測。

結(jié) 果

1.HE染色觀察各組小鼠子宮平滑肌組織結(jié)果:正常組小鼠子宮平滑肌細(xì)胞整齊，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界清晰，內(nèi)環(huán)行肌細(xì)胞呈流水狀，腺體上皮為單層柱狀上皮。模型組細(xì)胞排列紊亂且有明顯增生，膠原纖維與細(xì)胞間質(zhì)增多，細(xì)胞界限不清，細(xì)胞核多呈長桿狀，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界不清，腺體細(xì)胞增生，基本為復(fù)層柱狀上皮或假復(fù)層柱狀上皮。理沖湯組平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，增生情況較之于模型組大有緩解，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界比較清晰，腺體上皮基本為單層柱狀上皮。陽性藥物組平滑肌細(xì)胞排列較為整齊，細(xì)胞增生情況較之于模型組略輕，外縱行肌與內(nèi)環(huán)行肌分界比較清晰，腺體上皮基本為單層柱狀上皮(圖1)。

圖1 各組小鼠子宮平滑肌組織的變化(HE，×200)A.正常組;B.模型組;C.理沖湯組;D.陽性藥物組

2.MSD超敏多因子電化學(xué)發(fā)光法檢測子宮肌瘤模型小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的濃度：與正常組比較，模型組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ的濃度顯著降低(P<0.01)，而IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著升高(P<0.05，P<0.01)；陽性藥物組的IL-4、IL-5、IL-10的濃度也顯著升高(P<0.05，P<0.01)，理沖湯組僅IL-5的濃度與正常組比較顯著升高(P<0.01)，詳見表1。與模型組比較，理沖湯組小鼠血清中的IL-2、IFN-γ均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-10的濃度均顯著降低(P<0.05，P<0.01)；而陽性藥物組中的IL-2、IFN-γ均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，但I(xiàn)L-4、IL-5、IL-10的濃度變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 小鼠血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10的濃度

與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01

討 論

已有研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫逃逸機(jī)制密切相關(guān)。腫瘤細(xì)胞由于表觀遺傳的改變和基因組的不穩(wěn)定性而出現(xiàn)變異，免疫原性降低，平衡階段的休眠狀態(tài)被破壞，進(jìn)而變異的腫瘤細(xì)胞會在淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子的壓力下進(jìn)入逃逸階段，并建立免疫抑制性腫瘤微環(huán)境，進(jìn)行無限制的生長繁殖，最終形成臨床上所見的腫瘤。而在這個免疫逃逸過程中T淋巴細(xì)胞(簡稱T細(xì)胞)和各類細(xì)胞因子發(fā)揮了重要作用[8]。

筆者觀測的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-10主要是由淋巴細(xì)胞中的T細(xì)胞的亞群——輔助性T細(xì)胞分泌，此類細(xì)胞又被稱為Th細(xì)胞，其中的Th1細(xì)胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等，Th2細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等[9，10]。因此，IL-2、IFN-γ的表達(dá)能夠促進(jìn)Th1型免疫應(yīng)答，而IL-4、IL-5和IL-10的表達(dá)能夠促進(jìn)Th2型免疫應(yīng)答。

在正常情況下機(jī)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞處于平衡狀態(tài)，當(dāng)Th1細(xì)胞及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢之時便有抗腫瘤之功能，有研究稱Th1細(xì)胞可以通過將M2巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)換為經(jīng)典的促炎性M1巨噬細(xì)胞來抑制腫瘤，而且IL-2具有增強(qiáng)B細(xì)胞殺傷效應(yīng)的功能，IFN-γ更是多效細(xì)胞因子，能夠參與腫瘤免疫編輯的3個階段及炎性介導(dǎo)的腫瘤發(fā)生的過程，能夠防止腫瘤復(fù)發(fā)并能使其進(jìn)入休眠狀態(tài)[7，11～13]；但Th2細(xì)胞及其細(xì)胞因子占優(yōu)勢之時能夠使腫瘤逃脫免疫系統(tǒng)監(jiān)視，有研究稱IL-4為Th2型細(xì)胞反應(yīng)的起始物而且能夠促進(jìn)M2巨噬細(xì)胞極化，還能夠?qū)⒊Ｒ?guī)自然殺傷(cNK)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為IL4-NK細(xì)胞進(jìn)而能夠分泌IL-10，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡[13～15]。而IL-5不僅自身與其受體結(jié)合后能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移還能通過MMP-9/NF-κB/AP-1等途徑來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。Th2細(xì)胞占優(yōu)勢時是腫瘤免疫逃逸的機(jī)制之一，Th2細(xì)胞或其細(xì)胞因子比例升高時可促進(jìn)腫瘤的生長[17]。因此在治療腫瘤時，通過調(diào)控細(xì)胞因子向Th1狀態(tài)漂移，可促進(jìn)機(jī)體免疫功能的恢復(fù)，開啟機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答，達(dá)到縮小腫瘤甚至使腫瘤消失的目的。

在《景岳全書》中有敘述：“凡人之氣血猶源泉也，盛則流暢，少則壅滯”，即是說人在氣血虧虛之時，血行無力，易致瘀血；《中藏經(jīng)》有言：“積聚癥瘕雜蟲者……皆五臟六腑真氣失而邪氣并，遂乃生焉”，即意為子宮肌瘤是因臟腑功能失?；蛟?dú)馓撊醵抡?，又兼邪氣作祟而發(fā)生；《婦人大全良方》中也有提到“婦人癥痞，由飲食失節(jié)，脾胃虧損，邪正相搏，積于腹中，牢不可動，有可證驗(yàn)，故名曰癥”，也是說因飲食失節(jié)所指的脾胃虛弱，痰濕內(nèi)生，正虛邪盛，阻滯氣血運(yùn)行而致瘀阻胞宮則子宮肌瘤發(fā)生；在《血證論》中有述：“瘀血在經(jīng)絡(luò)臟腑之間，則結(jié)為癥瘕”，也說明了子宮肌瘤的發(fā)生與瘀血停積密切相關(guān)。因此可知子宮肌瘤的基本病因病機(jī)為正虛血瘀，其治則為扶正祛瘀。

本研究所用的出自張錫純先生《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》的理沖湯，是以扶正祛瘀法治療子宮肌瘤的代表方，方中三棱、莪術(shù)為化瘀血之要藥，能夠化血理氣，善治女子瘀血，并善消沖脈中的瘀血；方中又以黃芪、黨參等保護(hù)氣血，使瘀血去而不傷及氣血，而且參、芪得三棱、莪術(shù)流通之功更能夠使其補(bǔ)而不滯、元?dú)庥?，而元?dú)馔鷦t更能鼓勵三棱、莪術(shù)消癥之力，效果更佳；白術(shù)、山藥能健脾益氣，合黨參、黃芪補(bǔ)氣扶正；天花粉、知母能夠解黃芪、白術(shù)之熱，而且張錫純老先生善用知母配黃芪，黃芪溫補(bǔ)而知母寒潤，一陽一陰相互應(yīng)和；雞內(nèi)金不僅能夠健脾消食，使其開胃進(jìn)食進(jìn)而扶正起衰，此藥還能化瘀血而不傷氣分，輔助消癥；全方諸藥合用能夠健脾開胃進(jìn)食、益氣化血和血，共奏扶正行血、祛瘀消癥之功效。

本研究中，經(jīng)理沖湯干預(yù)后，采用MSD 超敏電化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測了Th1和Th2細(xì)胞中的相關(guān)細(xì)胞因子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠血清中的IL-2和IFN-γ濃度顯著降低，而IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著升高，提示子宮肌瘤的發(fā)生、發(fā)展與細(xì)胞因子介導(dǎo)的Th1/Th2平衡向Th2狀態(tài)漂移而導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸密切相關(guān)。與模型組比較，理沖湯組小鼠血清中的IL-2和IFN-γ濃度顯著升高，IL-4、IL-5、IL-10的濃度顯著降低，但是陽性藥物組中只有IL-2和IFN-γ顯著升高，而IL-4、IL-5、IL-10降低的幅度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而理沖湯可以通過提高Th1細(xì)胞因子的表達(dá)，降低Th2細(xì)胞因子的表達(dá)，促使機(jī)體免疫向Th1狀態(tài)漂移，防止子宮肌瘤發(fā)生免疫逃逸，抑制其發(fā)生、發(fā)展，提高機(jī)體免疫應(yīng)答能力。本研究結(jié)果顯示，理沖湯通過調(diào)控Th1、Th2細(xì)胞分泌因子的含量水平，影響免疫逃逸，進(jìn)而發(fā)揮抑制子宮肌瘤的作用。