宋玉娟 韓雪蓮 張安盛 王玉軍 高克祥 梁元存

摘 ?要：利用生防菌防治土傳病害是植物病害防治中的重要措施，在溫室盆栽條件下研究了棘孢木霉T-6對(duì)煙草促生和抗病效果。結(jié)果表明，棘孢木霉T-6對(duì)煙草黑脛病菌、煙草根黑腐病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別達(dá)49.62%、59.23%;溫室盆栽條件下，棘孢木霉T-6對(duì)黑脛病和根黑腐病的防治效果分別達(dá)到74.45%和75.14%。棘孢木霉T-6處理后提高了煙草葉片葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶的活性，棘孢木霉T-6處理的煙株生長(zhǎng)狀況明顯好于對(duì)照。棘孢木霉T-6能夠促進(jìn)煙株生長(zhǎng)和提高煙草對(duì)黑脛病和根黑腐病的抗性，具有良好的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：煙草;棘孢木霉T-6;黑脛病;根黑腐病;生物防治

Effects of?Trichoderma asperellum?T-6 on Growth Promotion， Control of Black Shank and Black Root Rot in Tobacco

SONG Yujuan¹， HAN Xuelian¹， ZHANG Ansheng²， WANG Yujun¹， GAO Kexiang¹， LIANG Yuancun^1*

（1. College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian， Shandong 271018， China; 2. Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan， 250100， China）

Abstract： UsingTrichodermaspp. to control plant soil-borne diseases is a promising field in biological control. In order to investigate the effect ofT. asperellumT-6 on tobacco growth and resistance to soil-borne fungi， spore suspensions ofT. asperellum?T-6 were inoculated into soil， and then pot experiments were conducted in greenhouse. The results showed that hyphal growth ofPhytophthora parasiticaandThielaviopsis basicolawas inhibited byT. asperellumT-6， and the inhibited rates were 49.62% and 59.23%， respectively. Control efficiency ofT. asperellumT-6 on black shank and black root rot reached 74.45% and 75.14%. AfterT. asperellumT-6 pretreatment， the content of chlorophyll and carotenoids and the activities of three resistance-related enzymes in tobacco leaves were increased， and the growth of tobacco treated withT. asperellumT-6 were better than control. Taken together， the results from this study indicated thatT. asperellum?T-6 could control tobacco black shank and black root rot effectively， and promote tobacco growth.

Keywords： tobacco;Trichoderma asperellum; black shank; black root rot; biological control

煙草黑脛病是煙草寄生疫霉（Phytophthora parasitica）引起的菌物性土傳病害，造成的年均損失約為12 303.3萬(wàn)元^[1-2]。煙草根黑腐病是由基生根串珠霉菌（Thielaviopsis basicola）引起的真菌性土傳病害，在我國(guó)各煙區(qū)均有發(fā)生，嚴(yán)重地塊發(fā)病率可達(dá)30%以上^[3]。近年來(lái)，由于煙草種植面積的調(diào)整，耕作制度及煙草品種的變化，煙草黑脛病和根黑腐病有加重趨勢(shì)^[1]。我國(guó)主要采用甲霜靈等化學(xué)農(nóng)藥來(lái)防治黑脛病和根黑腐病，長(zhǎng)期使用化學(xué)農(nóng)藥容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降^[4]和環(huán)境污染。

生物防治是煙草病害防治中的重要方法之一。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種具有防治煙草黑脛病和根黑腐病的生防菌。例如綠針假單胞菌（Pseudomonas chlororaphis）對(duì)煙草疫霉游動(dòng)孢子的釋放抑制率達(dá)52.24 %，對(duì)煙草黑脛病的盆栽防效達(dá)96.29%^[5]。拮抗放線菌吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）能夠抑制煙草根黑腐病病原菌菌絲的生長(zhǎng)，它的無(wú)菌濾液能夠抑制孢子萌發(fā)，即使孢子萌發(fā)，芽管也會(huì)畸形^[6]。本試驗(yàn)在溫室條件下研究棘孢木霉T-6 對(duì)煙草生長(zhǎng)發(fā)育的影響，探討其對(duì)煙草抗病性的誘導(dǎo)作用，旨在為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)木霉制劑提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗(yàn)材料

1.1.1? 供試生防菌和病原菌 ?棘孢木霉（Trichoderma asperellum） T-6及煙草黑脛病菌和根黑腐病菌由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2? 供試煙草品種 ?云煙87。

1.1.3? 供試培養(yǎng)基? PDA 培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）;燕麥培養(yǎng)基（燕麥30 g，瓊脂粉17 g，蒸餾水定容至1000 mL）。

1.2? 試驗(yàn)地點(diǎn)和方法

1.2.1? 試驗(yàn)地點(diǎn) ?本試驗(yàn)于2017—2018年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌和真菌病害實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2.2? PDA平板對(duì)峙拮抗試驗(yàn) ?黑脛病菌絲塊（直徑5 mm）接種至距培養(yǎng)皿平板（直徑9 cm）距中心2 cm處，25 ℃培養(yǎng)1 d后，在培養(yǎng)皿平板另一側(cè)距中心2 cm 處接種棘孢木霉T-6，以空白瓊脂塊為對(duì)照，28 ℃培養(yǎng)3 d后，測(cè)量黑脛病菌菌落直徑并計(jì)算抑菌率。抑菌率（%）=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。根黑腐病菌的對(duì)峙培養(yǎng)同上。

1.2.3? 孢子懸浮液的制備? 棘孢木霉T-6活化后在PDA平板上培養(yǎng)7 d，用無(wú)菌水洗脫孢子配制成濃度為1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹spores/mL的孢子懸浮液。黑脛病菌產(chǎn)孢采用梁元存等^[7]的方法，制備成濃度為1×10⁵spores/mL游動(dòng)孢子懸浮液。根黑腐病菌活化后在PDA平板上培養(yǎng)10 d，用無(wú)菌水洗脫孢子配制成濃度為2×10⁵spores/mL的孢子懸浮液。

1.2.4? 棘孢木霉對(duì)煙草的促生作用 ?分別設(shè)定1×10⁷、1×10⁸和1×10⁹spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液處理，每株煙草灌根接種20 mL孢子懸浮液（塑料盆內(nèi)徑12 cm，高度10 cm）。以20 mL無(wú)菌水為對(duì)照。木霉處理60 d后，取出煙株用清水洗凈根部，自然條件下風(fēng)干后測(cè)量煙株鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)、莖粗、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬，將煙株放置于烘箱中105 ℃殺青30 min，60 ℃繼續(xù)烘干48 h，取出測(cè)量整株干質(zhì)量。每處理15株，重復(fù)3次。

1.2.5? 棘孢木霉對(duì)黑脛病和根黑腐病防治效果? 從育苗盤中選擇長(zhǎng)勢(shì)一致苗齡60 d的煙苗移栽，緩苗一周。處理組：每株煙草灌根接種20 mL 1×10⁸spores/mL棘孢木霉T-6孢子懸浮液，2 d后，再接種5 mL的1×10⁵spores/mL煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL煙草根黑腐病菌孢子懸浮液。對(duì)照組：不接種棘孢木霉T-6孢子懸浮液，只接種5 mL的1×10⁵spores/mL煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液或5 mL的1×10⁵spores/mL煙草根黑腐病菌孢子懸浮液。每處理15株，重復(fù)3次。接種病原菌2周后，按照文獻(xiàn)[1]調(diào)查各處理煙株的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防效。

1.2.6? 煙草根系活力的測(cè)定 ?根系活力的測(cè)定參考白寶璋等^[8]的方法。

1.2.7 ?煙草葉片生理指標(biāo)的測(cè)定? 煙株用濃度為1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液灌根處理后，在2、4、6、8、10、12 d時(shí)，各處理取從上至下數(shù)第4片展開(kāi)的葉片，液氮速凍后研磨混勻，測(cè)定的生理指標(biāo)和方法包括：葉綠素含量的測(cè)定參考李合生^[9]的方法，過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）的活性測(cè)定參考張龍翔^[10]的方法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的活性測(cè)定參考高俊鳳^[11]的方法，過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）的活性測(cè)定參考劉萍等^[12]的方法。

1.2.8 ?數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) ?采用 DPS軟件，Duncan新復(fù)極差法，在0.05水平上分析差異顯著性。

2? 結(jié)? 果

2.1 ?棘孢木霉T-6對(duì)黑脛病菌和煙草根黑腐病菌的拮抗作用

對(duì)峙培養(yǎng)3 d后，棘孢木霉T-6對(duì)煙草黑脛病菌、煙草根黑腐病菌的抑制率分別達(dá)49.62%、59.23%，對(duì)照組和處理組病原菌的菌落半徑差異顯著（表1）。

處理組病原菌菌落邊緣的菌絲稀疏、長(zhǎng)勢(shì)減弱，而對(duì)照病原菌生長(zhǎng)正常，呈圓形向四周擴(kuò)展。繼續(xù)培養(yǎng)7 d后觀察到病原菌的菌落被棘孢木霉T-6吞噬覆蓋，說(shuō)明棘孢木霉T-6能夠重寄生2種病原菌（圖1）。

2.2? 棘孢木霉T-6對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育的影響

從表2可以看出，經(jīng)棘孢木霉T-6處理后，煙草的根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量均有明顯增加，而莖粗、最大葉長(zhǎng)、最大葉寬沒(méi)有顯著變化。其中濃度為1×10⁸spores/mL和1×10⁹spores/mL時(shí)比濃度為1×10⁷spores/mL的促生效果好，但兩者之間差異不顯著，因此從經(jīng)濟(jì)的角度來(lái)看，使用濃度為1×10⁸spores/mL的棘孢木霉T-6孢子懸浮液更適合。此時(shí)，它的根長(zhǎng)增加了58.14%，株高增加了45.37%，干質(zhì)量增加了67.65%，鮮質(zhì)量增加了77.44%。以上結(jié)果表明棘孢木霉T-6能有效改善煙草的農(nóng)藝性狀，提高生物量。

2.3? 棘孢木霉T-6對(duì)煙草黑脛病的防治效果

如表3所示，接種棘孢木霉T-6后病情指數(shù)為16.08，對(duì)照組的病情指數(shù)為62.94，防治效果達(dá)到了74.45%。經(jīng)棘孢木霉T-6處理的煙苗，接種黑脛病菌后植株發(fā)病明顯推遲，發(fā)病程度較輕，植株生長(zhǎng)發(fā)育正常。而對(duì)照煙苗發(fā)病嚴(yán)重，植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響，葉片變黃枯萎（圖2）。以上結(jié)果說(shuō)明棘孢木霉T-6可以增強(qiáng)煙草植株對(duì)黑脛病的抗病能力。

2.4? 棘孢木霉T-6對(duì)煙草根黑腐病的防治效果

如表4所示，經(jīng)棘孢木霉T-6處理的煙株發(fā)病較輕，其病情指數(shù)為13.71，顯著低于對(duì)照組55.14，對(duì)照植株生長(zhǎng)受到嚴(yán)重影響（圖3），根系大多壞死且呈黑色。防治效果達(dá)到了75.14%。以上結(jié)果說(shuō)明棘孢木霉T-6可以提高煙草對(duì)根黑腐病的抗病能力。

2.5 ?棘孢木霉T-6對(duì)煙草根系活力、葉綠素和類胡蘿卜素含量的影響

從圖4A可以看出，在棘孢木霉T-6處理2、4、6、8、10、12 d后，煙草根系活力分別高出對(duì)照組的68.63%、50.82%、59.26%、53.45%、22.81%、1.70%。圖4B表明，處理組的葉綠素含量與對(duì)照組差異顯著，在棘孢木霉T-6處理2、4、6、8、10、12 d后，處理組的葉綠素含量分別高出對(duì)照組的9.58%、31.5%、50.63%、43.56%、27.9%、32.49%。圖4C表明，處理組的類胡蘿卜素含量與對(duì)照相比差異顯著，在處理2、4、6、8、10、12 d后，處理組的類胡蘿卜素含量分別高出對(duì)照組3.27%、44.44%、47.17%、35.23%、57.46%、45.26%。以上結(jié)果均表明，棘孢木霉T-6能夠提高煙草根系活力，增加煙草葉片葉綠素和類胡蘿卜素的含量。

2.6 ?棘孢木霉T-6對(duì)煙草葉片中POD、SOD、CAT酶活性的影響

圖5顯示，接種棘孢木霉T-6的煙草葉片酶活性要高于對(duì)照，其中在接種棘孢木霉T-6 4 d時(shí)，3種酶活性達(dá)到最大值，此時(shí)處理煙株葉片的POD、SOD、CAT酶活性分別比對(duì)照高出47.26%、27.52%、46.78%，在測(cè)定的12 d內(nèi)，棘孢木霉處理的煙草3種酶活性均比對(duì)照高。這些結(jié)果表明棘孢木霉T-6能夠提高煙草體內(nèi)防御酶的活性。

3? 討? 論

目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)木霉對(duì)植物病原菌物病害的防治已有很多報(bào)道，但棘孢木霉菌在煙草上的生防研究較少。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T-6對(duì)煙草黑脛病的防治效果達(dá)到75.18%，對(duì)煙草根黑腐病的防治效果達(dá)到76.94%。說(shuō)明棘孢木霉T-6可以增強(qiáng)煙草植株對(duì)黑脛病、根黑腐病的抗病能力。棘孢木霉T-6生長(zhǎng)速度快，可較快占據(jù)營(yíng)養(yǎng)空間，而且對(duì)兩種病原菌都具有一定的抑菌和重寄生作用，這是棘孢木霉T-6參與抗病的生防機(jī)制。

有研究發(fā)現(xiàn)棘孢木霉T437能夠促進(jìn)黃瓜根系的生長(zhǎng)^[13]。一些生防細(xì)菌如地衣芽孢桿菌W10對(duì)煙草根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量都有明顯的促生作用^[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)棘孢木霉T-6處理后，根長(zhǎng)、株高、鮮質(zhì)量、干質(zhì)量都有顯著的增加。木霉菌株能和植物建立共生關(guān)系，通過(guò)穿透植物的表皮在植物根系定殖并且產(chǎn)生刺激植物生長(zhǎng)和誘導(dǎo)植物防御反應(yīng)的化合物。

葉綠素和類胡蘿卜素是是衡量植物光合作用能力的重要指標(biāo)，對(duì)植物的生長(zhǎng)起決定性作用。根系能夠吸收無(wú)機(jī)鹽和水分，并且合成一些重要的物質(zhì)，它是植物的重要器官之一。有研究表明短芽孢桿菌DZQ3處理煙株后，煙草體內(nèi)的葉綠素含量比對(duì)照高出17.03%，煙草的根系活力高出對(duì)照38.34%，并且顯著促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育^[15]。吳秉奇等^[16]發(fā)現(xiàn)煙草根際拮抗菌多粘類芽孢桿菌處理煙草后，煙草體內(nèi)的葉綠素含量比對(duì)照高出14.97%，根系活力比對(duì)照高出13.13%，煙草的農(nóng)藝性狀和生物量都有顯著增加。本試驗(yàn)表明，經(jīng)過(guò)棘孢木霉T-6處理后，煙草體內(nèi)的葉綠素含量、類胡蘿卜素含量和根系活力均顯著高于對(duì)照組，最終提高煙草的光合速率，加快碳水化合物的合成以滿足煙草生長(zhǎng)的需要，根系活力的提高有利于煙草根系吸收土壤養(yǎng)分，促進(jìn)煙草的生長(zhǎng)。這也是棘孢木霉T-6對(duì)煙草的促生長(zhǎng)機(jī)制之一。

研究表明，生物因子和非生物因子等多種誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性^[17-18]，導(dǎo)致植物體內(nèi)SOD、POD、CAT等防御酶活性的升高。POD是植物體內(nèi)的一種重要的防御酶，參與合成木質(zhì)素，能夠催化酚類的氧化。SOD和CAT與植物體內(nèi)活性氧的清除密切相關(guān)^[19]。張良等^[20]發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)柄木霉和涇陽(yáng)鏈霉菌復(fù)配能夠顯著增加煙草體內(nèi)SOD、POD、CAT的活性。FUCHS^[21]研究表明生防菌能使植株產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)植物抗性的產(chǎn)生。本試驗(yàn)研究表明，棘孢木霉T-6能夠顯著提高煙草葉片中POD、SOD、CAT的活性。其中處理組的POD、SOD、CAT的酶活性均在第4天時(shí)出現(xiàn)了峰值，并且酶活性一直高于對(duì)照組。這些結(jié)果表明棘孢木霉T-6可提高煙草抗病相關(guān)的酶活性，從而合成更多的抗病相關(guān)產(chǎn)物，增強(qiáng)煙草對(duì)病害的抵抗力。

4? 結(jié) ?論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，棘孢木霉T-6能提高煙草對(duì)黑脛病和根黑腐病兩種土傳菌物病害的抗性和抗病相關(guān)防御酶活性，并對(duì)煙草有較好的促生作用。但本文試驗(yàn)僅為溫室盆栽結(jié)果，關(guān)于棘孢木霉T-6田間應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步研究。

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