溫秀紅，吳小翠，郭 芳,肖 引

(1.西安新通藥物研究有限公司，陜西 西安 710077；2.武警陜西省總隊(duì)醫(yī)院，陜西 西安 710054)

1 引言

醋酸艾司利卡西平是 Sunovion Pharma 開發(fā)的 S-利卡西平醋酸酯前藥，是一種新型抗癲癇藥物，S-利卡西平是奧卡西平的主要活性代謝產(chǎn)物，通過阻止電壓門控鈉通道來產(chǎn)生抗驚厥作用[1]。醋酸艾司利卡西平口服吸收快、半衰期長、藥物動力學(xué)呈線性，無明顯的藥物相互關(guān)系。與卡馬西平、奧卡西平相比較，醋酸艾司利卡西平治療效果更加顯著[2]。醋酸艾司利卡西平于2009年在歐洲上市，商品名為Zebinix，2013年被 FDA 批準(zhǔn)用于成人癲癇部分性發(fā)作，目前國內(nèi)還未上市[3-4]。目前，2015版《中國藥典》、《美國藥典》、《英國藥典》和《歐洲藥典》均未收載本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，因此，本文對自主研發(fā)合成工藝路線下可能產(chǎn)生的雜質(zhì)進(jìn)行分析，對醋酸艾司利卡西平有關(guān)物質(zhì)開發(fā)了相應(yīng)的分析方法，并對其進(jìn)行方法學(xué)研究。

2 儀器與試藥

島津LC-2010AHT 高效液相色譜儀；梅特勒GB204電子天平；醋酸艾司利卡西平對照品(批號：D140302，來源：西安新通藥物研究有限公司)；起始物料(批號：BH-AB03081-140316，來源：上海瀚鴻化工科技有限公司)；中間體I(批號：ESL-1-140402，來源：西安新通藥物研究有限公司)；中間體II(批號：ESL-2-140402，來源：西安新通藥物研究有限公司)；雜質(zhì)A(批號：A140301，來源：西安新通藥物研究有限公司)；奧卡西平(批號：100657-201102，來源：中國藥品生物制品檢定所)；環(huán)氧化物(批號：14-AZC-52-1，來源：加拿大TRC公司)；磷酸氫二鉀(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，水為純化水。

3 雜質(zhì)分析

根據(jù)我們自主研發(fā)的合成工藝，本品可能引入的雜質(zhì)情況如下：(1)從合成工藝路線分析，以10-甲氧基亞氨基芪為起始物料，反應(yīng)生成中間體I，中間體I經(jīng)過不對稱還原反應(yīng)后生成中間體II和中間體II對映體，再經(jīng)過乙酰化反應(yīng)后，與氯磺酰異氰酸酯發(fā)生取代反應(yīng)得到醋酸艾司利卡西平。(2)本品為乙酸酯類，不穩(wěn)定，容易在堿性中水解，生成雜質(zhì)A。(3)本品結(jié)構(gòu)中的手性來源于不對稱還原反應(yīng)過程，故成品中可能還會存在對映異構(gòu)體。(4)本品體內(nèi)代謝產(chǎn)物可能產(chǎn)生奧卡西平及卡馬西平環(huán)氧化物。綜合上述分析結(jié)果，本品中主要雜質(zhì)：各反應(yīng)中間體、水解雜質(zhì)A、奧卡西平及卡馬西平環(huán)氧化物以及對映異構(gòu)體。

4 方法與結(jié)果

4.1 色譜條件[5]

色譜柱：sepax C-18(150 mm×4.6 mm,5 μm填料)；流動相A為0.01 mol/L磷酸氫二鉀-甲醇(80∶20)，流動相B為乙腈-甲醇-水(75∶5∶20)，梯度洗脫程序見表1；檢測波長：210 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure

4.2 專屬性

4.2.1 樣品配制

空白溶劑：甲醇。

系統(tǒng)混合溶液：稱取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質(zhì)A、奧卡西平和環(huán)氧化物約10mg，分別置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)儲備液，分別取奧卡西平和環(huán)氧化物雜質(zhì)儲備液50μL，取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質(zhì)A儲備液250μL，置含有醋酸艾司利卡西平約10mg 的25mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液。

表2 強(qiáng)制降解樣品制備Tab.2 Preparation of forced degradation sample

4.2.2 測定方法

分別取上述溶液個10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1～圖4。

4.2.3 結(jié)果

圖1 有關(guān)物質(zhì)混合溶液色譜圖Fig.1 chromatogram of related compound for Mix solution

圖2 強(qiáng)制降解重疊圖(1)Fig.2 overlap chromatogram of forced degradation(1)

圖3 強(qiáng)制降解重疊圖(2)Fig.3 overlap chromatogram of forced degradation(2)

4.2.4 峰純度試驗(yàn)

選用強(qiáng)制降解樣品溶液，在帶光二極管陣列檢測器的液相色譜儀中進(jìn)樣，檢測峰純度。結(jié)果顯示強(qiáng)制降解溶液和未降解溶液的主峰峰純度大于其單點(diǎn)純度閾值，可表明在此實(shí)驗(yàn)條件下，主峰中未包裹其他雜質(zhì)，表明本系統(tǒng)適用性良好。

4.2.5 結(jié)論

從上述系統(tǒng)溶液看出，各雜質(zhì)的分離度均符合要求。從上述強(qiáng)制降解試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，雜質(zhì)A主要在酸堿破壞條件下產(chǎn)生，且均為主要降解雜質(zhì)，是由本品結(jié)構(gòu)中七元環(huán)上的酯鍵斷裂形成。其他條件下，幾乎沒有雜質(zhì)降解產(chǎn)生。在各降解條件下，主峰純度良好，未包裹其他雜質(zhì)，雜質(zhì)之間以及雜質(zhì)與主峰之間的分離度良好，色譜條件良好。

4.3 線性關(guān)系考察

取醋酸艾司利卡西平對照品約25 mg ，置25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL 置100 mL量瓶中，再精密量入濃度為0.04 mg/mL的各雜質(zhì)儲備液各1 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為測定溶液。精密吸取測定溶液5,8,10,12和15 μL，按"4.1"項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度(X,ng)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果顯示，各雜質(zhì)在約相當(dāng)于供試品進(jìn)樣量的0.05%～0.15%范圍之間，線性關(guān)系良好，見表3。

圖4 強(qiáng)制降解重疊圖(3)Fig.4 overlap chromatogram of forced degradation(3)

表3 線性關(guān)系Tab.3 linear relation

4.4 重復(fù)性試驗(yàn)

取本品約10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別配制6份，精密吸取10 μL進(jìn)樣，記錄色譜圖。結(jié)果顯示，6份供試品溶液雜質(zhì)量均無明顯差異，均只檢出一個未知雜質(zhì)，未知雜質(zhì)含量均為0.06%，表明重復(fù)性良好。

4.5 回收率試驗(yàn)

取本品約10 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為本底溶液，精密量取本底溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照溶液；再精密量取含起始原料，中間體I，中間體II，雜質(zhì)A，奧卡西平和環(huán)氧化物約 0.004 mg/mL的各雜質(zhì)溶液125,250和375 μL，分別置于已加入本品約10 mg的25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，分別作為限度濃度50%、100%和150%的溶液，平行配置三份。分別精密量取上述溶液10 μL，記錄色譜圖，各雜質(zhì)按照加校正因子的自身對照法計算測得量，將測得量減去本底含量，除以加入量計算回收率。結(jié)果起始物料、中間體I、中間體II、雜質(zhì)A、奧卡西平、環(huán)氧化物回收率分別為91.8%,90.8%,86.9%,99.9%,87.2%和87.9%，RSD分別為6.6%,5.9%,4.3%,5.4%,4.4%和4.7%。

4.6 檢測限與定量限試驗(yàn)

取醋酸艾司利卡西平適量，加甲醇配制成一定濃度的溶液，按信噪比S/N應(yīng)不小于3和信噪比S/N應(yīng)不小于10分別確立檢測限和定量限。同時計算檢測限和定量限時進(jìn)樣濃度。結(jié)果表明，當(dāng)樣品濃度為0.4 mg/mL時，定量限符合檢測靈敏度要求，能被有效檢出。

4.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品約10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，做為供試品溶液，放置于室溫條件下，分別在0,2,4,6和8 h進(jìn)樣，記錄色譜圖。圖譜顯示，供試品溶液隨著放置時間的延長，雜質(zhì)A降解產(chǎn)生，在8 h內(nèi)由未檢出增長到0.07%，表明供試品溶液不穩(wěn)定，因此需臨用新制。

4.8 耐用性試驗(yàn)

稱取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質(zhì)A、奧卡西平和環(huán)氧化物約10 mg，分別置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為雜質(zhì)儲備液，分別取奧卡西平和環(huán)氧化物雜質(zhì)儲備液50 μL，取起始原料、中間體Ⅰ、中間體Ⅱ、雜質(zhì)A儲備液250 μL，置含有醋酸艾司利卡西平約10 mg 的25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合溶液。分別選用色譜柱sepax C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、DIKMA C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、IntertSustain C-18(4.6×150 mm，5 μm)和Xtimate C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)及島津LC-2010AHT高效液相色譜儀和waters alliance 2486高效液相色譜儀進(jìn)行測定。結(jié)果表明，當(dāng)更換不同色譜柱，更換不同型號和品牌色譜儀器時，雖然雜質(zhì)和主峰保留時間有所差異，主峰的保留時間在10～17 min之間變化，但均能實(shí)現(xiàn)各已知雜質(zhì)與主峰的分離和檢測，方法耐用性良好。

5 討論

本文建立的HPLC分析方法能實(shí)現(xiàn)醋酸艾司利卡西平與雜質(zhì)，雜質(zhì)與雜質(zhì)的有效分離，其中溫度對于醋酸艾司利卡西平及其有關(guān)物質(zhì)的保留時間有影響，但對分離度沒有顯著影響，在最終建立的梯度色譜條件下，各成分間達(dá)到比較理想的分離。

通過對樣品的強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、氧化、水浴、光照、高溫破壞試驗(yàn)，結(jié)果顯示主峰及已知雜質(zhì)分離度良好，該檢測方法能有效檢測本品有關(guān)物質(zhì)。通過溶液穩(wěn)定性考察，本品供試品溶液隨著放置時間的延長，雜質(zhì)A降解產(chǎn)生，在8 h內(nèi)由未檢出增長到0.07%，表明供試品溶液不穩(wěn)定，因此在樣品檢測過程中，溶液應(yīng)臨用現(xiàn)配。

本文開發(fā)的醋酸艾司利卡西平有關(guān)物質(zhì)的檢查方法，用來檢測除對映異構(gòu)體以外的有關(guān)物質(zhì)。方法學(xué)考察表明該色譜方法靈敏度高，可以有效檢出降解雜質(zhì)，二極管陣列檢測器檢測峰純度符合要求，證明本方法具有專屬性，能夠滿足雜質(zhì)檢測的需要。