宿偉鵬 張 洋 張宋安 劉 攀 趙化榮

食管癌(esophageal carcinoma, EC)病死率位居惡性腫瘤第6位，是世界第八大常見惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為15%～25%[1]。主要表型分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma, EAC)及食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，其中ESCC多發(fā)于中國及亞太其他地區(qū)，年發(fā)生率超過40萬例，占總發(fā)生率的90%[2]。目前常用治療手段有內(nèi)鏡下切除治療、外科手術(shù)、放射治療(以下簡稱放療)及化學(xué)治療(以下簡稱化療)等，其中化療方案中常用紫杉醇(paclitaxel, PTX)配合治療方案。紫杉醇是由紅豆杉樹皮中分離提純的具有良好抗腫瘤效果的天然次生代謝產(chǎn)物，是繼阿霉素和順鉑后最有效的廣譜抗癌藥物，可作用于微管，抑制細(xì)胞有絲分裂，破壞細(xì)胞周期，被廣泛應(yīng)用于治療食管癌、頭頸癌、乳腺癌、肺癌等諸多惡性腫瘤[3～5]。另一方面，近年來腫瘤干細(xì)胞學(xué)的新興提示腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells, CSCs)可能是腫瘤化療抵抗的根本原因，而紫杉醇對食管癌腫瘤干細(xì)胞的作用及機(jī)制未見闡明[6,7]。因此，本研究旨在通過分離食管鱗癌干細(xì)胞(ESCC-CSCs)，通過紫杉醇誘導(dǎo)，進(jìn)一步探究紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞干性的作用及其作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料:人食管癌細(xì)胞TE-13細(xì)胞系(ATCC)；PBS、胰蛋白酶、胎牛血清和1640培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)；Hoechst33342、碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液、維拉帕米(中國碧云天公司)；CD44、SOX2免疫熒光抗體(CST)；紫杉醇(2mg/ml，大連美侖生物公司)；CCK-8試劑盒(美國AbMole公司)；B27(美國Invitrogen公司)；人重組表皮因子、堿性成纖維上皮生長因子、肝素(美國Sigma-Aldrich公司)；胰島素(400U/支，江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司)；TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(天根生化科技有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、蛋白Marker(中國碧云天公司)；p-TAZ、TAZ、CD44、SOX2多克隆抗體、IgG(美國Santa cruz公司)；PCR檢測引物由金斯瑞生物科技有限公司設(shè)計合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

2.ESCC-CSCs細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定:(1)ESCC-CSCs細(xì)胞的分離及培養(yǎng):以人食管鱗癌細(xì)胞系TE-13細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2～3代后取對數(shù)生長期細(xì)胞2×106個/毫升單細(xì)胞懸液，分別加入6μg/ml Hoechst33342、100mmol/L維拉帕米，室溫孵育90min，染色結(jié)束后迅速轉(zhuǎn)移細(xì)胞至4℃冰上終止染色。離心沉淀細(xì)胞，F(xiàn)ACS緩沖液重懸細(xì)胞至1×107個/毫升，加入2μg/ml PI后過400目濾網(wǎng)上流式細(xì)胞儀參照側(cè)群細(xì)胞(side population cells, SP細(xì)胞)的分離分選方法，測量前向散射和側(cè)向散射參數(shù)[8]。以Hoechst red為X軸，Hoechst blue為Y軸做二維散點(diǎn)圖，取低Hoechst red/blue及維拉帕米缺失的區(qū)域為目標(biāo)SP細(xì)胞，即ESCC-CSCs，收集分選出的SP細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)傳代，進(jìn)行后續(xù)實驗。(2)ESCC-CSCs細(xì)胞鑒定:取2～4代ESCC-CSCs細(xì)胞消化重懸后均勻滴加在共聚焦專用皿底部中央，待細(xì)胞貼壁生長至50%密度后棄培養(yǎng)基，冰PBS洗滌細(xì)胞2次，分別避光加入CD44抗體(FITC標(biāo)記)和SOX2抗體(藻紅蛋白標(biāo)記)與Hoechst33342共染色30min，棄染液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞后上機(jī)觀察并采集照片。(3)分組及處理:實驗分為兩組：空白對照組(NC)及實驗組(PTX)，空白對照組ESCC-CSCs細(xì)胞不做任何處理，實驗組細(xì)胞依據(jù)實驗需要加入終濃度為1.25μg/ml的紫杉醇處理，收集處理后的各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

3.CCK-8:收集處于對數(shù)生長期的ESCC-CSCs細(xì)胞，消化離心后重懸至5×104個/毫升接種至96孔板中，每孔接種100μl，實驗組細(xì)胞培養(yǎng)基中含1.25μg/ml的紫杉醇，常規(guī)培養(yǎng)0、24、48、72h后，每孔加入10μl CCK-8溶液，37℃培養(yǎng)箱中孵化4h，上酶標(biāo)儀檢測各孔細(xì)胞在450nm處的吸光度(A)值。每組5個副孔，取平均值。

4.克隆形成實驗:ESCC-CSCs細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理誘導(dǎo)48h后，消化收集2組細(xì)胞，重懸調(diào)整細(xì)胞密度至1×103個/孔，充分吹打至單個細(xì)胞后將細(xì)胞懸液接種至預(yù)熱的含10ml 1640培養(yǎng)基的100mm培養(yǎng)皿中，輕輕搖動分散細(xì)胞，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3周。棄培養(yǎng)基，用冰PBS潤洗培養(yǎng)皿3次，加入4ml 4%多聚甲醛固定液固定細(xì)胞克隆，移除固定液，加入適量1%結(jié)晶紫染色液避光染色30min，染色結(jié)束后用冰PBS反復(fù)緩慢沖洗培養(yǎng)皿至PBS不再變色，棄去PBS，室溫晾干后觀察并記錄克隆形成數(shù)目。

5.干細(xì)胞成球?qū)嶒?1640完全培養(yǎng)基中加入B27(1∶50)、20ng/ml人重組表皮因子、20ng/ml堿性成纖維上皮生長因子、40g/ml肝素及50g/ml胰島素配置成干細(xì)胞培養(yǎng)基。ESCC-CSCs細(xì)胞經(jīng)紫杉醇處理誘導(dǎo)48h后，消化收集兩組細(xì)胞，以5×103個/孔密度接種于低黏附6孔板內(nèi)，加入干細(xì)胞培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)10天后，顯微鏡下觀察并采集圖像，記錄每孔中直徑>75μm的細(xì)胞球個數(shù)(a)，計算細(xì)胞球形成效率(sphere formation efficiency, SFE)，SFE(%)=(a/接種細(xì)胞總數(shù))×100%。

6.Western blot法檢測相關(guān)蛋白表達(dá):將各組處理后的單層生長的細(xì)胞用冰PBS緩慢沖洗2次，加入含1%PMSF的RIPA裂解液1ml至覆蓋全部培養(yǎng)板，置于冰上孵育30min，用細(xì)胞刮將帖壁細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，4℃12000r/min離心20min取上清。經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后，各取50mg蛋白加入等體積1×SDS上樣緩沖液，沸水浴10min變性蛋白質(zhì)。行10%SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將上述蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，抗體孵育后檢測目的蛋白條帶表達(dá)情況。

7.Real-time PCR檢測相關(guān)mRNA表達(dá):收集經(jīng)紫杉醇誘導(dǎo)處理48h后的ESCC-CSCs細(xì)胞及對照組細(xì)胞，參照TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNAs，以GAPDH作為內(nèi)參基因使用qRT-PCR試劑盒對待測mRNA進(jìn)行定量擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系25μl，預(yù)設(shè)PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，設(shè)置40次循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束后設(shè)置95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s做溶解曲線。采用2-ΔΔCt相對定量分析方法檢測細(xì)胞中相關(guān)mRNA表達(dá)水平。實驗過程中每組樣本配置3個副孔，取平均值記錄分析，同時做陰性對照排除反應(yīng)體系中PCR污染及引物二聚體干擾。

8.統(tǒng)計學(xué)方法:采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，并進(jìn)行兩兩比較。所有細(xì)胞功能實驗均重復(fù)3次，取平均值后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 ESCC-CSCs的分離及鑒定(熒光染色，×200)A、B.TE-13細(xì)胞系經(jīng)熒光活化細(xì)胞分選：A.采用Hoechst33342標(biāo)記分選的TE-13細(xì)胞中SP細(xì)胞約占29.3%；B.SP細(xì)胞與維拉帕米共孵育后，細(xì)胞所占比例降至1.3%；C～E.Hoechst與SOX2同時對分選出的細(xì)胞染色圖像采集及組合；F～H.Hoechst與CD44同時對分選出的細(xì)胞染色圖像采集及組合

結(jié) 果

1.ESCC-CSCs分選與鑒定:通過流式分選TE-13細(xì)胞中SP細(xì)胞群，如圖1A、B所示，排除死細(xì)胞和細(xì)胞碎片，基于散射信號及PI熒光，篩選到SP細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的29.3%；同時細(xì)胞與維拉帕米共孵育后，SP細(xì)胞所占比例僅為1.3%，由此說明細(xì)胞對Hoechst33342的排除是由維拉帕米敏感導(dǎo)致的。進(jìn)一步通過免疫熒光染色鑒定分選所得細(xì)胞，Hoechst染色確定細(xì)胞核位置呈藍(lán)色熒光，潛在的食管鱗癌干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD44及SOX2用于表征ESCC-CSCs干細(xì)胞特性，CD44抗體呈綠色熒光，SOX2抗體呈紅色熒光，同一視野下拍攝并組合Hoechst與二者熒光圖片。如圖1C～H所示，分選的SP細(xì)胞均表達(dá)SOX2及CD44，可以判斷ESCC-CSCs細(xì)胞提取成功。

2.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細(xì)胞增殖:CCK-8檢測紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞體外增殖能力的影響，如圖2所示，體外給予紫杉醇處理24h后，實驗組較對照組細(xì)胞體外增殖能力開始受到顯著抑制(P<0.01)，且隨時間的增加，紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞增殖能力的抑制增強(qiáng)，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。

圖2 CCK-8檢測紫杉醇對ESCC-CSCs體外增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.01，**P=0.000

3.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細(xì)胞克隆形成及體外成球:克隆形成實驗進(jìn)一步說明紫杉醇可以抑制ESCC-CSCs細(xì)胞體外增殖及克隆形成能力，如圖3A～C所示，給予紫杉醇誘導(dǎo)后細(xì)胞體外增殖干性顯著降低，克隆形成數(shù)量較對照組顯著減少(P<0.01)；成球?qū)嶒灲Y(jié)果表明，在經(jīng)紫杉醇處理后ESCC-CSCs細(xì)胞成球率SFE顯著低于對照組細(xì)胞(P<0.01)，且觀察到球體直徑明顯小于對照組細(xì)胞球，如圖3D～F所示，由此說明紫杉醇抑制ESCC-CSCs細(xì)胞體外成球及自我更新能力。

圖3 紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞克隆形成及體外成球能力的影響(×40)A～C.克隆形成檢測對照組(A)和實驗組(B)體外克隆形成情況及定量統(tǒng)計結(jié)果(C)；D～F.成球?qū)嶒灆z測對照組(D)和實驗組(E)體外干細(xì)胞成球能力及各組體外SFE統(tǒng)計結(jié)果(F)

4.紫杉醇抑制ESCC-CSCs細(xì)胞內(nèi)TAZ、CD44、SOX2關(guān)鍵蛋白表達(dá):Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)變化，如圖4A、B所示，給予紫杉醇作用后ESCC-CSCs細(xì)胞內(nèi)TAZ、CD44、SOX2蛋白表達(dá)水平顯著降低，與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)，反之磷酸化的TAZ(p-TAZ)較對照組蛋白表達(dá)量顯著增加；qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA分子變化情況，如圖4C顯示，紫杉醇可顯著抑制ESCC-CSCs細(xì)胞內(nèi)CD44及SOX2 mRNA表達(dá)(P=0.000)，而對TAZ mRNA表達(dá)無顯著影響。

圖4 紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞內(nèi)TAZ、CD44、SOX2等關(guān)鍵蛋白及mRNA表達(dá)的影響A、B.Western blot法檢測ESCC-CSCs細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平(A)及定量分析結(jié)果(B)；C.細(xì)胞內(nèi)相關(guān)mRNA表達(dá)水平檢測；與對照組比較，*P=0.000

討 論

腫瘤干細(xì)胞(CSCs)是腫瘤中一群與正常組織干細(xì)胞具有相似功能，且具有長期自我更新及分化為子代細(xì)胞能力的細(xì)胞亞群，具有無限增殖、自我更新、多向分化的潛能[9，10]。近年來研究表明，CSCs能抵抗常規(guī)的放療及化療，參與腫瘤的化療藥物耐藥等重要過程[11，12]。發(fā)現(xiàn)并識別多種腫瘤的干細(xì)胞及其作用機(jī)制為腫瘤的靶向治療提供了新的方向。Hippo信號通路最早被發(fā)現(xiàn)可以通過抑制增殖和促進(jìn)凋亡參與調(diào)控器官大小，并且具有高度的保守性，在人類及多種生物中都能找到相似功能的成員[13]。另一方面，近年來的研究表明Hippo作為抑腫瘤信號同時參與調(diào)控乳腺癌、肝癌等多種腫瘤干細(xì)胞的干細(xì)胞性能維持及癌癥進(jìn)程[14～16]。本研究旨在通過探究紫杉醇對ESCC-CSCs干細(xì)胞性能及相關(guān)Hippo信號分子變化，闡明紫杉醇干擾ESCC-CSCs細(xì)胞功能抑制食管癌的作用機(jī)制。

通過側(cè)群細(xì)胞分離法對TE-13細(xì)胞系中可能存在的干細(xì)胞進(jìn)行篩選，如圖1所示，干細(xì)胞中含有的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中ABCG2(ATP-binding cassette superfamily G member 2)可將干細(xì)胞中Hoechst染料泵出胞內(nèi)。因此，基于散射信號及PI熒光選定低Hoechst red信號、低Hoechst blue信號區(qū)域。同時，將細(xì)胞與維拉帕米共孵育后，維拉帕米發(fā)揮ABC家族蛋白抑制劑的作用，阻斷由ABCG2引發(fā)的細(xì)胞外排Hoechst，選定維拉帕米缺失的區(qū)域，二者共同篩選得到SP細(xì)胞群，可認(rèn)為是TE-13細(xì)胞系中具有干細(xì)胞特性的ESCC-CSCs細(xì)胞。進(jìn)一步參考相關(guān)文獻(xiàn)報道，選取CD44、SOX2為ESCC-CSCs細(xì)胞特異性標(biāo)志物，檢測篩選所得細(xì)胞中CD44、SOX2的表達(dá)，進(jìn)一步確定所得ESCC-CSCs的干細(xì)胞特性[17，18]。通過體外給予紫杉醇誘導(dǎo)后，筆者分別從細(xì)胞增殖、克隆形成及成球?qū)嶒?個方面觀察到紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞干性存在顯著抑制(圖2、圖3)，為進(jìn)一步探究紫杉醇抑制ESCC-CSCs干細(xì)胞特性的分子機(jī)制，分別從mRNA及蛋白水平對Hippo信號通路關(guān)鍵蛋白TZA、干性調(diào)控因子SOX2、CD44的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測，如圖4所示，結(jié)果顯示紫杉醇誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)TAZ、CD44及SOX2蛋白表達(dá)減少，同時p-TAZ表達(dá)增加，而TAZ mRNA表達(dá)不依賴紫杉醇誘導(dǎo)發(fā)生變化，CD44、SOX2 mRNA表達(dá)水平變化與蛋白表達(dá)變化一致，均受紫杉醇的抑制。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，CD44、SOX2高表達(dá)于正常的干細(xì)胞中參與調(diào)控細(xì)胞干性的維持[18]。紫杉醇誘導(dǎo)后，細(xì)胞分裂受阻相關(guān)CD44、SOX2 mRNA分子轉(zhuǎn)錄受到抑制，進(jìn)一步造成了蛋白水平CD44、SOX2表達(dá)的降低。另一方面，TAZ蛋白減少與其mRNA表達(dá)無關(guān)，推測紫杉醇可能通過激活Hippo信號抑制TAZ的功能。相關(guān)研究表明，伐地那非等藥物可通過促進(jìn)Hippo信號通路中MST和Lats的磷酸化進(jìn)一步促進(jìn)TAZ的S89位點(diǎn)的磷酸化，從而引起TAZ后續(xù)泛素化降解失活。因此，通過檢測ESCC-CSCs細(xì)胞中p-TAZ蛋白表達(dá)量的變化，發(fā)現(xiàn)給予紫杉醇誘導(dǎo)后ESCC-CSCs細(xì)胞中TAZ磷酸化程度增加(p-TAZ表達(dá)增加)，與TAZ表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，這提示在食管癌中紫杉醇可能通過激活Hippo信號中MST和Lats蛋白激酶活化進(jìn)一步促進(jìn)TAZ磷酸化，抑制TAZ轉(zhuǎn)錄活性和生物學(xué)功能的作用，最終發(fā)揮抑制ESCC-CSCs細(xì)胞干性的作用。

綜上所述，筆者認(rèn)為紫杉醇可通過作用于Hippo信號通路中TAZ、SOX2、CD44等關(guān)鍵分子蛋白，參與調(diào)控食管癌干細(xì)胞干性，抑制癌干細(xì)胞異常增殖和移植瘤的轉(zhuǎn)移，但與此同時，Hippo中涉及的多種復(fù)雜的分子信號機(jī)制是否參與紫杉醇對ESCC-CSCs細(xì)胞干性的調(diào)控仍有待于開展多方面的深入研究。