馮俊鵬 ， 徐 瑞，2 ， 唐玉玲 ， 嚴(yán) 翊

(1.北京體育大學(xué)運(yùn)動人體科學(xué)學(xué)院 ， 北京 海淀 100084 ； 2.南京體育學(xué)院運(yùn)動健康學(xué)院 ， 江蘇 南京 210014 ； 3.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193)

KISS-1/GPR54被認(rèn)為是青春期啟動的“開關(guān)”，其中KISS-1調(diào)節(jié)生殖軸并作為青春期開始的分子開關(guān)[1]。隨著動物進(jìn)入青春期，生殖激素開始發(fā)揮作用。下丘腦促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,GnRH)可刺激垂體前葉分泌的促性腺激素(Gonadotropins,Gn)、黃體生成激素(Luteinizing hormone,LH)和卵泡刺激激素(Follicle-stimulating hormone,FSH)增加。促性腺激素通過血液循環(huán)系統(tǒng)刺激、調(diào)節(jié)性腺的發(fā)育和功能。近幾年來，KISS-1已被鑒定為下丘腦-垂體-性腺軸的上調(diào)基因，KISS-1在哺乳動物繁殖中的作用得到了廣泛的研究。KISS-1主要由下丘腦神經(jīng)元分泌，并通過刺激GnRH神經(jīng)元上的同源受體GPR54起作用，然后激活調(diào)節(jié)青春期開始和生殖功能的下游基因。多年來關(guān)于KISS-1/GPR54研究的主要熱點(diǎn)都在HPG軸上游的定位和功能，目前已經(jīng)明確KISS-1/GPR54在多種組織中表達(dá)，特別是在胰腺和性腺中表達(dá)水平較高。

相關(guān)研究已經(jīng)在人類[2]、小鼠[3]、大鼠[4]和青蛙的睪丸中檢測到GPR54的表達(dá)，進(jìn)一步增加了KISS-1也可以在睪丸發(fā)育中起作用的可能性。同時(shí)，KISS-1已被發(fā)現(xiàn)能在小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)[5]。對于在人類精子中檢測出的KISS-1和GPR54，主要的部位局限于精子的頭部、頸部和鞭毛的中段[2]。然而，不同的研究對于KISS-1/GPR54在睪丸中的表達(dá)定位暫無一致結(jié)論，故暫無法推測KISS-1/GPR54在睪丸發(fā)育中的功能。由于在生長期過程中，大鼠睪丸結(jié)構(gòu)和功能迅速成熟，故動態(tài)研究生長期過程中大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達(dá)的變化情況對于進(jìn)一步探究KISS-1/GPR54在睪丸發(fā)育中的生理功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級3周齡(第21天)離乳大鼠，共60只，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(許可證編號：SCXK京2012-0001)。經(jīng)北京體育大學(xué)動物福利倫理委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號：2016021A)，動物分籠飼養(yǎng)，室溫20～24 ℃，相對濕度40%～60%，每日12 h光照/12 h熄燈，大鼠自由飲水、飲食。飼料采用高脂對照飼料，購自美國Research Diets公司(貨號：D12451B)。

1.2 取樣 根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果和相關(guān)文獻(xiàn)，確定第21天、第35天、第43天、第56天為4個(gè)取材時(shí)間點(diǎn)。大鼠稱重后，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為0.025 mL/(kg·bw)。待麻醉后，腹主動脈取血，分別取兩側(cè)睪丸，剝離睪周脂肪及附睪后稱重，并將一側(cè)睪丸置于4%多聚甲醛中固定待用；另一側(cè)睪丸于冰上剪碎，迅速用編好號的錫箔紙分包成2份，置于液氮中，后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.3 主要試劑 KISS-1抗體(免疫組化用KISS-1 抗體，MABC60，Millipore產(chǎn)品)；GPR54抗體(免疫組化用GPR54 抗體，GTX37417，GeneTex產(chǎn)品)；KISS-1抗體(WB用KISS-1抗體，ab19028，Abcam產(chǎn)品)；GPR54抗體(WB用GPR54抗體，bs-2501R，Bioss產(chǎn)品)；二抗(Goat Anti-Rabbit IgG H&L，ab6721，Abcam產(chǎn)品)；內(nèi)參(GAPDH 抗體，ab8245，Abcam產(chǎn)品)。

1.4 免疫組化確定KISS-1/GPR54定位 制備睪丸組織石蠟切片后，石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，下行至蒸餾水，進(jìn)行抗原修復(fù)，羊血清工作液封閉后，滴加已稀釋好的一抗(KISS-1抗體稀釋比1∶500，GPR54抗體稀釋比1∶100)，4 ℃過夜，然后采用通用型二步法反應(yīng)，滴加DAB顯色液，室溫避光作用2～10 min，經(jīng)0.1 mol/L pH 7.4 的PBS藍(lán)化作用15 min，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明后，中性樹膠封片，鏡下觀察拍照(Olympus BX43)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Quantitative real-time PCR,RT-qPCR)測定KISS-1/GPR54基因表達(dá) 通過Primer-BLAST檢索出相應(yīng)基因的引物序列，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。按說明書步驟提取總RNA、合成cDNA，進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)。

1.6 Western Blot測定KISS-1/GPR54蛋白表達(dá) 按說明書步驟進(jìn)行總蛋白提取和Western Blot樣品制備。將樣品置于15孔預(yù)制膠中，連接電泳儀，將電壓調(diào)至140 V，時(shí)間為130 min，待Marker條帶分層至10 kDa分子量標(biāo)記顯現(xiàn)時(shí)停止電泳。轉(zhuǎn)膜后一抗封閉，在4 ℃下?lián)u床過夜；第2天，二抗封閉，在4 ℃下?lián)u床封閉1 h。TBST清洗后，進(jìn)行曝光，曝光液分A、B液，按1∶1比例現(xiàn)用現(xiàn)配，準(zhǔn)備高敏、超敏2種發(fā)光液，分別進(jìn)行曝光，結(jié)果以圖片形式進(jìn)行保存。用成像系統(tǒng)(ChemiDocTM XRS+System,Bio-Rad)讀取條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，使用Image Lab進(jìn)行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示。所有數(shù)據(jù)在進(jìn)行分析前經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，符合標(biāo)準(zhǔn)后，采用重復(fù)測量方差分析對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，取P<0.05 為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義顯著差異，P<0.01為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義極顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化情況 在第21天、第35天、第43天、第56天4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行動態(tài)取材，各時(shí)間點(diǎn)大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化見表1。如表1所示，大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)在第21天至第35天階段均出現(xiàn)明顯增加(P<0.01)，其中體重、睪重均隨鼠齡增加而增加(P<0.05)。對于體重，大鼠的體重發(fā)育具有一定的階段性，本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠在第21天至第35天處于第1個(gè)生長高峰，第35天至第43天大鼠體重增加速度放緩，第21天至第35天體重增長速度最快。大鼠的睪丸重量及睪丸指數(shù)可以體現(xiàn)大鼠的睪丸發(fā)育水平，本試驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，隨著鼠齡的增加，大鼠的睪丸重量不斷增加，第21天至第35天是大鼠睪丸重量增長最快的階段，后逐漸放緩。大鼠睪重的變化趨勢與體重基本一致。而大鼠的睪丸指數(shù)并不一直增加，在經(jīng)過第21天至第35天的明顯增加后基本穩(wěn)定。

表1 生長期大鼠體重、睪重、睪丸指數(shù)變化情況Table 1 Changes of body weight,testis weight and testis index of growth period rats

2.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54蛋白表達(dá)定位情況 KISS-1/GPR54在生長期各階段大鼠睪丸的生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均見表達(dá)，見中插彩版圖1。

2.3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達(dá)情況 生長期各取樣點(diǎn)大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA表達(dá)情況如表2所示。對于KISS-1 mRNA表達(dá)情況，可以看出在第35天處明顯升高出現(xiàn)表達(dá)峰值(P<0.01)，隨后雖略有下降但第43天和第56天較第35天均無顯著性差異(P>0.05)。對于GPR54 mRNA表達(dá)情況，可以看出第21天至第35天 表達(dá)情況幾乎沒有變化，第35天至第43天表達(dá)上升(P<0.01)并在第43天出現(xiàn)峰值，隨后雖然在第43天至第56天出現(xiàn)下降，但第56天較第43天表達(dá)量無顯著性差異(P>0.05)。

表2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR 54 mRNA表達(dá)情況Table 2 KISS-1/GPR 54 mRNA expression in the testis of growth period rats

2.4 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達(dá)情況 生長期各取樣點(diǎn)大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達(dá)情況如表3所示。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸中KISS-1蛋白表達(dá)逐漸增高且各時(shí)間點(diǎn)較前一時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P<0.05)，特別是在第21天至第35天和第43天至第56天2個(gè)階段出現(xiàn)非常顯著性差異(P<0.01)。隨著鼠齡的增加，大鼠睪丸GPR54表達(dá)也逐漸增加，第21天至第35天階段無明顯變化，第35天至第43天階段蛋白表達(dá)極明顯升高(P<0.01)，第43天至第56天階段基本不變。

表3 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達(dá)情況Table 3 KISS-1/GPR54 protein expression in the testis of growth period rats

3 討論

3.1 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 蛋白表達(dá)定位 對于不同種動物的睪丸中KISS-1/GPR54表達(dá)的定位問題研究結(jié)果不一，在對五指山豬[6]和黃牛[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，在睪丸間質(zhì)細(xì)胞、各階段的生精細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)KISS-1的表達(dá)，也有研究發(fā)現(xiàn)雄性大鼠睪丸的生精細(xì)胞中有KISS-1的表達(dá)，但在間質(zhì)細(xì)胞中無表達(dá)。相關(guān)研究結(jié)果不一致影響進(jìn)一步探究KISS-1/GPR54在睪丸中的生理功能。本試驗(yàn)通過對于生長期大鼠睪丸進(jìn)行動態(tài)取點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，從第21天開始KISS-1/GPR54在大鼠的間質(zhì)細(xì)胞和生精細(xì)胞中均見表達(dá)，且隨著青春期發(fā)育，在生精細(xì)胞的表達(dá)量增加。

許孟杰[8]對ICR小鼠的KISS-1/GPR54的蛋白表達(dá)定位進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)針對ICR小鼠KISS-1僅分布于間質(zhì)細(xì)胞，GPR54在精子細(xì)胞中特異性表達(dá)，而不是精原細(xì)胞、精母細(xì)胞或支持細(xì)胞。鑒于睪丸存在的“血睪屏障”結(jié)構(gòu)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞所分泌的KISS-1無法與精子細(xì)胞中表達(dá)的GPR54結(jié)合產(chǎn)生作用，推測睪丸間質(zhì)細(xì)胞所分泌的KISS-1另有功能。Anjum等[9]從出生到衰老各階段小鼠睪丸中KISS-1的表達(dá)定位進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在出生時(shí)在精原細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)KISS-1，隨著生長發(fā)育精原細(xì)胞中KISS-1免疫染色后顏色加深，睪丸間質(zhì)細(xì)胞中顏色變淺，到青春期期間睪丸間質(zhì)細(xì)胞中顏色變深，進(jìn)入衰老期KISS-1主要集中在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)。其他對于小鼠的研究也發(fā)現(xiàn)不同鼠齡特別是處于生殖周期的不同階段，KISS-1/GPR54表達(dá)定位結(jié)果不同。據(jù)此可以推斷，KISS-1/GPR54可能參與大鼠精子成熟和性激素分泌，但在生殖周期的不同階段KISS-1/GPR54在大鼠睪丸中的生理功能可能有所不同。

3.2 生長期大鼠睪丸KISS-1/GPR54 mRNA和蛋白的表達(dá)情況 本試驗(yàn)采用動態(tài)取點(diǎn)的方法，取離乳期(第21天)、青春期前期(第35天)、青春期(第43天)、青春期后期(第56天)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1/GPR54 mRNA在大鼠睪丸中均有表達(dá)，且呈現(xiàn)一定的時(shí)序性變化趨勢。就KISS-1 mRNA表達(dá)情況來看，從第21天至第35天這個(gè)時(shí)間段，大鼠睪丸中KISS-1 mRNA表達(dá)明顯增高，在第35天出現(xiàn)峰值，隨后略有降低但無顯著性差異。就GPR54 mRNA表達(dá)情況而言，第21天至第35天這個(gè)時(shí)間段GPR54表達(dá)基本穩(wěn)定，第35天至第43天時(shí)間段出現(xiàn)顯著性增加，第43天至第56天表達(dá)出現(xiàn)下降但無顯著性差異。對比可以發(fā)現(xiàn)，GPR54表達(dá)峰值的出現(xiàn)晚于KISS-1表達(dá)峰值?？赡苡捎贙ISS-1對于能量變化更為敏感有關(guān)，且GPR54為KISS-1的受體，當(dāng)KISS-1表達(dá)增高并積累到一定程度時(shí)GPR54表達(dá)才出現(xiàn)增高。KISS-1/GPR54 蛋白在大鼠睪丸中均有表達(dá)，與mRNA的表達(dá)結(jié)果一致，但也表現(xiàn)出一定的時(shí)序性特點(diǎn)。就KISS-1蛋白表達(dá)情況來看，隨著鼠齡的增加，KISS-1蛋白表達(dá)逐漸增加，在第43天至第56天表達(dá)增加更加明顯，在第56天出現(xiàn)峰值。就GPR54蛋白表達(dá)情況來看，第21天至第35天GPR54蛋白表達(dá)基本保持不變，在第35天至第43天出現(xiàn)明顯的增加，第43天至第56天基本保持不變，在第56天出現(xiàn)峰值。綜上，KISS-1/GPR54在睪丸中表達(dá)蛋白峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)晚于mRNA峰值出現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)，且KISS-1峰值出現(xiàn)早于GPR54峰值的出現(xiàn)。

許孟杰[8]用細(xì)胞分離的方法研究發(fā)現(xiàn)，KISS-1 mRNA主要表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞，GPR54 mRNA主要表達(dá)于生精小管細(xì)胞，而非睪丸間質(zhì)細(xì)胞。曾泰祥[10]發(fā)現(xiàn)，對于12周齡的ICR小鼠KISS-1與GPR54都高度表達(dá)于睪丸的睪丸間質(zhì)細(xì)胞中，由此推測，KISS-1可能分泌自睪丸間質(zhì)細(xì)胞并作用于睪丸間質(zhì)細(xì)胞本身而形成自分泌(Autocrine)路徑。此外，同樣的試驗(yàn)對于4周齡未進(jìn)入青春期的ICR小鼠，發(fā)現(xiàn)未進(jìn)入青春期的ICR小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞的KISS-1和GPR54表達(dá)量顯著低于青春期后的小鼠。根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，雖然KISS-1可能通過自分泌途徑直接作用于睪丸，但是KISS-1/GPR54系統(tǒng)在生殖功能調(diào)節(jié)中的確切生理作用仍有待闡明。

4 小結(jié)

本試驗(yàn)表明，KISS-1/GPR54在生長期大鼠睪丸生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞均表達(dá)。大鼠睪丸中KISS-1/GPR54表達(dá)呈現(xiàn)一定的時(shí)序性，mRNA和蛋白表達(dá)趨勢基本一致，第21天至第56天整體上均呈現(xiàn)一定的表達(dá)上升的趨勢。據(jù)此推測在生殖周期的不同階段，大鼠睪丸中KISS-1/GPR54的生理功能可能有所不同。