牛小飛 ， 王宏艷 ， 連朋敬 ， 白 玉 ， 李靜云 ， 張子卉 ， 楊俊琦 ， 趙立紅 ， 喬 健

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 北京 海淀 100193 ； 2. 河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院 ， 河北 邯鄲 056038)

肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae,S.pn)是一種定植于人體鼻咽部的革蘭陽(yáng)性球菌，屬于條件性致病菌，可引起肺炎、腦膜炎、菌血癥等多種疾病[1]。肺炎鏈球菌性疾病是全球嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一，也是導(dǎo)致兒童、老年人及免疫缺陷群體發(fā)病和死亡的重要原因，全球每年約200萬(wàn)人死于S.pn感染[2]。全反式維甲酸(All-trans retinoic acid,ATRA)是維生素A的天然代謝產(chǎn)物，其作為營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和免疫調(diào)節(jié)劑在臨床上應(yīng)用十分廣泛，是孕婦和兒童補(bǔ)充維生素A，以及治療兒童麻疹、痤瘡、夜盲癥、急性早幼粒細(xì)胞白血病等的一線用藥[3-7]。因此，由于抵抗力下降而誘發(fā)S.pn感染的人群與龐大的ATRA使用人群必然會(huì)發(fā)生重疊。另外，研究表明，ATRA能夠通過(guò)核受體信號(hào)通路調(diào)控肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和基因表達(dá)及肺部的免疫反應(yīng)[8]，而肺又是S.pn最主要的靶器官，因此，當(dāng)ATRA使用人群同時(shí)發(fā)生S.pn感染時(shí)，ATRA的應(yīng)用是否會(huì)影響肺部的免疫反應(yīng)，從而影響S.pn對(duì)機(jī)體的致病性是一個(gè)亟待解決的科學(xué)問(wèn)題，但目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。為此，本研究評(píng)估了使用不同劑量的ATRA對(duì)S.pn致病性的影響，為臨床上應(yīng)用ATRA 的人群在感染S.pn后的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 THB培養(yǎng)基、酵母浸粉，均購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；ATRA、棉籽油，均購(gòu)自Sigma公司；異氟烷，購(gòu)自河北一品制藥股份有限公司。

1.2 主要儀器 電子天平(YP40001)，上海越平科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；生物安全柜(BSC-1100 II A2)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；紫外可見分光光度計(jì)(T6)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)菌 6～8周齡，雄性，SPF級(jí)BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；S.pn(NCTC7466)，由重慶醫(yī)科大學(xué)惠贈(zèng)。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將152只BALB/c小鼠隨機(jī)分為8組，分別為空白對(duì)照組、ATRA1對(duì)照組、ATRA2對(duì)照組、ATRA3對(duì)照組、感染組、ATRA1感染組、ATRA2感染組、ATRA3感染組，每組19只，其中14只用于檢測(cè)體重、采食量和存活率，5只用于檢測(cè)肺系數(shù)和肺組織病變。小鼠腹腔注射棉籽油或ATRA 10 d，第11天鼻腔接種PBS或S.pn。空白對(duì)照組，注射棉籽油后接種PBS；ATRA1對(duì)照組、ATRA2對(duì)照組、ATRA3對(duì)照組，分別注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接種PBS；感染組，注射棉籽油后接種S.pn； ATRA1感染組、ATRA2感染組、ATRA3感染組，分別注射1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA后接種S.pn。

1.4.2 ATRA的配制及使用 稱取一定量ATRA粉末，將其溶于二甲基亞砜(DMSO)，然后加入棉籽油，將其配制成1、5、10 mg/(kg·bw) 注射液，給小鼠腹腔注射0.2 mL/次，1次/d，連續(xù)注射10 d。空白對(duì)照組注射棉籽油。

1.4.3S.pn的培養(yǎng)及接種劑量的確定 將S.pn接種于THY培養(yǎng)基(THB培養(yǎng)基中加入0.5%酵母浸粉)，37 ℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，4 ℃、5 000 r/min離心10 min后收集沉淀，PBS洗2次，再用PBS制成細(xì)菌懸液。將細(xì)菌懸液用PBS稀釋成不同濃度后，給小鼠鼻腔接種，根據(jù)其臨床癥狀及死亡情況確定接種劑量。本研究中，S.pn的接種劑量為1.6×108CFU/mL，0.1 mL/只，此時(shí)小鼠有明顯的臨床癥狀但不會(huì)死亡。

1.4.4 體重、采食量、存活率變化的測(cè)定 體重、采食量和存活率是反映病原致病性的國(guó)際通用指標(biāo)。本研究將小鼠用異氟烷麻醉后鼻腔接種S.pn，連續(xù)6 d記錄體重、采食量和死亡情況，并根據(jù)以下公式計(jì)算體重變化率、采食量變化率及存活率：體重變化率=當(dāng)天體重/初始體重×100%；采食量變化率= 當(dāng)天采食量/初始采食量×100%；存活率=存活數(shù)/總數(shù)×100%。

1.4.5 肺系數(shù)和肺組織病變檢查 肺系數(shù)和肺組織病變是反映肺水腫和肺損傷程度的重要指標(biāo)。在感染后6 h，各組小鼠用過(guò)量的異氟烷麻醉使其安樂(lè)死，稱量體重后剖檢，取全肺稱重，按以下公式計(jì)算肺系數(shù)：肺系數(shù)=全肺重量(mg)/體重(g)，并將肺組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經(jīng)脫水、透明、包埋、切片后進(jìn)行蘇木素-伊紅(H.E.)染色，顯微鏡下觀察并記錄病理變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”方式表示。采用SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間的比較采用單因素方差分析(ANOVA)法、存活率用log-rank (Mantel-Cox) test法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 ATRA對(duì)小鼠感染S.pn后體重的影響 由表1可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，體重?zé)o顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對(duì)照組相比，體重顯著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，體重?zé)o顯著差異(P>0.05)；5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，體重均顯著下降(P<0.05)。

表1 ATRA對(duì)小鼠感染S. pn后體重的影響Table 1 Effects of ATRA on body weight in mice infected with S. pn

2.2 ATRA對(duì)小鼠感染S.pn后采食量的影響 由表2可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，采食量無(wú)顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對(duì)照組相比顯著下降(P<0.05)；1 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；5 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，在感染后第6天顯著降低(P<0.05)； 10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，在感染后第3、6天顯著降低(P<0.05)。

表2 ATRA對(duì)小鼠感染S. pn后采食量的影響Table 2 Effects of ATRA on food intake in mice infected with S. pn

2.3 ATRA對(duì)小鼠感染S.pn后存活率的影響 由表3可知，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組、感染組存活率均為100%，與空白對(duì)照組相同；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組存活率分別為100%、85.71%、71.43%，1、5 mg/(kg·bw) ATRA 感染組與感染組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比差異顯著(P<0.05)。

表3 ATRA對(duì)小鼠感染S. pn后存活率的影響Table 3 Effects of ATRA on survival rate in mice infected with S. pn [% (n1/n),n=14]

2.4 ATRA對(duì)小鼠感染S.pn后肺系數(shù)的影響 感染后6 h小鼠肺系數(shù)變化結(jié)果如圖1所示，1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著差異(P>0.05)；感染組與空白對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

圖1 ATRA對(duì)小鼠感染S. pn后肺系數(shù)的影響Fig.1 Effects of ATRA on lung coefficient in mice infected with S. pn

2.5 ATRA對(duì)小鼠感染S.pn后肺組織病變的影響感染后6 h小鼠肺組織病變?nèi)缰胁宀拾鎴D2所示，1、5 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比無(wú)顯著變化，10 mg/(kg·bw) ATRA對(duì)照組與空白對(duì)照組相比，肺泡膈輕度增厚；感染組與空白對(duì)照組相比，肺泡膈輕度增厚，毛細(xì)血管輕度充血；1、5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組與感染組相比，隨著ATRA劑量增加，肺組織病變程度逐漸增加，表現(xiàn)為肺泡膈增厚及充血程度增加，炎性細(xì)胞增多。

3 討論

S.pn是導(dǎo)致人類細(xì)菌性肺炎最重要的病原。ATRA是維生素A的活性代謝產(chǎn)物，在臨床上應(yīng)用非常廣泛。ATRA能夠通過(guò)核受體信號(hào)通路調(diào)控肺上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和基因表達(dá)及肺部的免疫反應(yīng)[8]。研究表明，缺乏維生素A的孟加拉國(guó)新生兒，在補(bǔ)充維生素A后死亡率降低[9]；新生兒患S.pn肺炎后，補(bǔ)充維生素A可抑制成年期哮喘的發(fā)展[10]。而對(duì)于成年后由于各種原因使用ATRA對(duì)機(jī)體感染S.pn有無(wú)影響未見報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用維甲酸可增強(qiáng)S.pn對(duì)小鼠的致病性，且隨著ATRA劑量的增加，S.pn對(duì)小鼠的致病性逐漸增強(qiáng)。具體表現(xiàn)為：與感染組相比，5、10 mg/(kg·bw) ATRA感染組的體重、采食量和存活率均降低；肺系數(shù)升高；肺組織病變程度增加；且10 mg/(kg·bw) ATRA感染組比5 mg/(kg·bw) ATRA感染組的嚴(yán)重程度增加。本研究中，維甲酸在S.pn感染中不但沒(méi)有發(fā)揮有利的調(diào)節(jié)作用，反而使S.pn的致病性增強(qiáng)。目前關(guān)于ATRA對(duì)呼吸道感染的影響的報(bào)道中結(jié)果并不一致，營(yíng)養(yǎng)不良或有更嚴(yán)重疾病的兒童最有可能從ATRA中獲益[9]。而給亞臨床維生素A缺乏的兒童服用大劑量維生素A后，其急性呼吸道感染的發(fā)病率反而增加[11]。另有研究報(bào)道，應(yīng)用高水平的ATRA會(huì)導(dǎo)致肺組織的病理?yè)p傷，其原因可能是由于ATRA能夠使肺組織致敏[12]。綜上所述，我們推測(cè)在本研究中，使用ATRA后能夠增強(qiáng)S.pn對(duì)機(jī)體的致病性，其原因有可能是連續(xù)給予小鼠ATRA后，機(jī)體肺組織處于致敏狀態(tài)，引起肺組織損傷，從而對(duì)S.pn的抵抗力降低所致。本研究提示，臨床上應(yīng)用維甲酸的人群在感染S.pn后風(fēng)險(xiǎn)增加，本研究對(duì)公共衛(wèi)生具有重要的指導(dǎo)價(jià)值。