張 璐 ， 張純萍 ， 李偉杰 ， 趙 琪 ， 徐錦濤

(1. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 海淀 100081 ； 2. 青島初心動(dòng)物醫(yī)院管理有限公司 ， 山東 青島 266109)

沙門(mén)菌(Salmonella)屬腸桿菌科中的人獸共患病原菌，其宿主廣泛，既可以水平傳播又可以垂直傳播，對(duì)畜禽產(chǎn)業(yè)和人類(lèi)食品的安全危害嚴(yán)重[1]。被沙門(mén)菌污染的雞肉制品是人感染沙門(mén)菌最主要的來(lái)源之一。沙門(mén)菌血清型種類(lèi)眾多，不同血清型對(duì)家禽和人類(lèi)所引起的臨床癥狀及造成的危害程度也不同[2]。雞感染沙門(mén)菌后可引起雞白痢、禽傷寒和輸卵管感染等疾病，人感染后會(huì)導(dǎo)致傷寒樣發(fā)熱、惡心、嘔吐、腹部絞痛和腹瀉等感染性疾病。

目前我國(guó)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)300多種血清型[3]。研究表明，我國(guó)的雞源沙門(mén)菌血清型以雞白痢、腸炎、鼠傷寒為主[4]，但不同年代的優(yōu)勢(shì)血清型差異較大[5]。研究血清型的變化對(duì)了解沙門(mén)菌流行情況和監(jiān)測(cè)公共衛(wèi)生數(shù)據(jù)具有重要意義。隨著抗菌藥物在家禽中的預(yù)防性和治療性的應(yīng)用，雞源沙門(mén)菌的耐藥性也越來(lái)越嚴(yán)重[6]。鑒于此，文章對(duì)1970—2015年雞源沙門(mén)菌進(jìn)行了血清分型和藥敏試驗(yàn)，旨在比較不同年代沙門(mén)菌的流行趨勢(shì)和對(duì)抗菌藥物的耐藥性變化，為家禽沙門(mén)菌的防控和公共衛(wèi)生安全提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 共收集到菌株412株，其中1970—1980年菌株(38株)、1981—2000年菌株(12株)為獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存，2001—2010年菌株(169株)為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室保存，2011—2015年菌株(193株)為中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所動(dòng)物源細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室和獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心保存。血清型鑒定的陽(yáng)性菌株來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所安全評(píng)價(jià)室已鑒定出的沙門(mén)菌。藥敏試驗(yàn)的質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922和ATCC35218，均購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 培養(yǎng)基、材料 SWARM半固體瓊脂，購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂、沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基，均購(gòu)自青島海博生物有限公司；沙門(mén)菌分型(180種)血清，購(gòu)自丹麥血清研究所；革蘭陰性需氧菌藥敏板、藥敏接種培養(yǎng)液、5 mL生理鹽水，均購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)有限公司；DNA marker DL-2 000，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；2× GoTaqGreen Master Mix試劑，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 菌株鑒定 菌株通過(guò)營(yíng)養(yǎng)瓊脂進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后提取單菌落接種于沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上，(36±1) ℃培養(yǎng)24 h，典型的沙門(mén)菌在沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基上呈紫色。對(duì)初步純化后為沙門(mén)菌的菌株通過(guò) PCR 檢測(cè)沙門(mén)菌持家基因invA。根據(jù)是否檢出invA基因來(lái)鑒定沙門(mén)菌[7]。PCR反應(yīng)體系為25 μL：2×Mix 12.5 μL；上下游引物(50 μmol/L)各0.25 μL；模板2 μL； 加ddH2O 10 μL補(bǔ)足25 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s， 60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。1.2%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，必要時(shí)進(jìn)行測(cè)序判定是否為沙門(mén)菌。

1.4 血清型鑒定 用無(wú)菌槍頭挑取營(yíng)養(yǎng)瓊脂上的菌落與菌體(O)抗原多價(jià)血清充分混勻，30 s內(nèi)觀看凝集反應(yīng)，若凝集則說(shuō)明具有對(duì)應(yīng)的O抗原，鞭毛(H)抗原的檢測(cè)需要在SWARM半固體瓊脂上培養(yǎng)，并以已知沙門(mén)菌的菌株為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水為陰性對(duì)照，即檢驗(yàn)菌株在生理鹽水中無(wú)自凝現(xiàn)象。根據(jù)O抗原和H抗原的檢測(cè)結(jié)果對(duì)照沙門(mén)菌屬抗原表[8]確定血清型。

1.5 藥敏試驗(yàn) 試驗(yàn)選擇臨床常用的具有代表性的12種抗菌藥物進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，并根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[9]，采用微量肉湯稀釋法對(duì)不同年代沙門(mén)菌進(jìn)行耐藥性特征分析：挑取2～3個(gè)單菌落置5 mL滅菌生理鹽水中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，調(diào)制菌液濃度為1×108～2×108CFU/mL；取菌液60 μL加入12 mL的藥敏接種培養(yǎng)液中，進(jìn)行混勻稀釋?zhuān)梦⑸镒詣?dòng)加樣儀加入96孔革蘭陰性需氧菌藥敏板中，每孔100 μL，陰性對(duì)照孔單獨(dú)加入100 μL藥敏接種培養(yǎng)液，37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～20 h。在陰性對(duì)照孔清澈，陽(yáng)性對(duì)照孔渾濁以及質(zhì)控菌株的最低抑菌濃度符合規(guī)定范圍的前提下，根據(jù)CLSI藥敏判定標(biāo)準(zhǔn)[9]進(jìn)行被檢菌株的敏感性：敏感(S)、中度敏感(I)或耐藥(R)，未有菌生長(zhǎng)的最低濃度即為該菌株對(duì)此抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC)值，若所有濃度下均見(jiàn)菌生長(zhǎng)，則該菌株對(duì)此抗菌藥物的MIC值為大于其最高稀釋濃度。

2 結(jié)果

2.1 沙門(mén)菌的鑒定 412株菌株通過(guò)沙門(mén)菌顯色培養(yǎng)基和PCR方法共純化鑒定出雞源沙門(mén)菌共328株，其中1970—1980年38株，1981—2000年12株，2001—2010年143株，2011—2015年135株。

2.2 血清型鑒定 對(duì)不同年代的328株沙門(mén)菌進(jìn)行血清分型，其中255株為可分型沙門(mén)菌，22株為Ⅱ型菌株并有51株未鑒定出血清型。由表1所示，255株沙門(mén)菌共分為10種不同的血清型，雞源沙門(mén)菌在1970—2000年的優(yōu)勢(shì)血清型為雞白痢，2000年以后腸炎沙門(mén)菌為主要血清型，其次為雞白痢，并且出現(xiàn)山夫登堡等多種的血清型。

表1 不同年代沙門(mén)菌的血清型分布Table 1 Serotypes distribution of Salmonella in different ages

2.3 MIC檢測(cè) 試驗(yàn)對(duì)不同時(shí)期的沙門(mén)菌進(jìn)行了12種抗菌藥物的耐藥性檢測(cè)，所有菌株對(duì)阿莫西林/克拉維酸、慶大霉素、美羅培南、阿奇霉素、恩諾沙星敏感，對(duì)其他7種抗菌藥物耐藥性結(jié)果如表2所示。1970—2000年分離的雞白痢沙門(mén)菌僅對(duì)頭孢噻呋、黏菌素、磺胺異噁唑出現(xiàn)低水平的耐藥，2001—2010年分離的雞白痢沙門(mén)菌對(duì)黏菌素、磺胺異噁唑的耐藥率升高，并對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氟苯尼考出現(xiàn)耐藥，但對(duì)頭孢噻呋的耐藥率為0。2011—2015年分離的雞白痢沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑的耐藥率有所下降。從2001—2010年開(kāi)始，腸炎沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、黏菌素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑出現(xiàn)耐藥，2011—2015年腸炎沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑耐藥率大幅度上升。雞白痢沙門(mén)菌的總體耐藥水平以及多重耐藥率明顯高于腸炎沙門(mén)菌。

表2 不同年代沙門(mén)菌對(duì)不同抗菌藥物耐藥率Table 2 The resistance rate of Salmonella to different antimicrobial agents in different ages (%)

3 討論

試驗(yàn)菌株來(lái)源廣泛，所用的血清型為系統(tǒng)的丹麥血清型，分型結(jié)果準(zhǔn)確。從1970—2015年分離的雞源沙門(mén)菌主要血清型為雞白痢和腸炎。雞白痢沙門(mén)菌從20世紀(jì)70年代到2015年間一直是貫穿我國(guó)家禽養(yǎng)殖業(yè)的重要血清型之一。這一結(jié)果與王建舫等[10]在2009年對(duì)禽源沙門(mén)菌研究的血清型以及施開(kāi)創(chuàng)等[11]在2015年對(duì)雞源沙門(mén)菌研究的血清型結(jié)果一致。雞白痢是導(dǎo)致家禽高發(fā)病率和高死亡率的主要血清型，加強(qiáng)對(duì)雞白痢的凈化工作尤為重要。

腸炎沙門(mén)菌在2000年以后大量出現(xiàn)，并逐漸成為沙門(mén)菌的優(yōu)勢(shì)血清型之一。張秀英等[12]2007年鑒定的雞源沙門(mén)菌血清型主要為腸炎。趙建梅等[13]2008—2017年鑒定的雞源沙門(mén)菌血清型主要為腸炎。其比例的增多可能與雞場(chǎng)雞白痢的凈化有關(guān)，其次，腸炎沙門(mén)菌感染成年禽的死亡率較低，臨床癥狀不明顯，可長(zhǎng)期定植于腸道和生殖道中并長(zhǎng)期排菌傳播，導(dǎo)致腸炎沙門(mén)菌菌株不斷增多[14]。近幾年，腸炎沙門(mén)菌的比例也明顯超過(guò)了雞白痢[4,15]。自2000年后試驗(yàn)鑒定出了山夫登堡、哈達(dá)爾等多種血清型，這可能是由于進(jìn)出口貿(mào)易的增長(zhǎng)，國(guó)內(nèi)外沙門(mén)菌的交叉感染以及抗原的變異導(dǎo)致血清型的種類(lèi)逐漸增多。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，雞白痢在20世紀(jì)70—80年代的耐藥率較低，在2000—2010年對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、氟苯尼考、黏菌素、磺胺異噁唑的耐藥率急劇升高，但在2011—2015年有所下降。我國(guó)從20世紀(jì)60年代開(kāi)始就有研究發(fā)現(xiàn)，雞白痢沙門(mén)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物、四環(huán)素、慶大霉素等藥物的耐藥性呈現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的趨勢(shì)[16]。代娟娟等[17]研究2002—2007年雞白痢對(duì)四環(huán)素的耐藥率逐漸增強(qiáng)，且對(duì)磺胺類(lèi)藥物一直具有很高的耐藥率，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。沈欣悅等[18]研究2013—2017年雞白痢對(duì)四環(huán)素的耐藥率呈下降趨勢(shì)，與本試驗(yàn)中四環(huán)素的耐藥趨勢(shì)一致。

腸炎沙門(mén)菌隨時(shí)間的變化對(duì)氨芐西林、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑的耐藥率逐漸增強(qiáng)。崔苗苗[19]等研究的2017年腸炎沙門(mén)菌對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑等耐藥性較強(qiáng)，而對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星等藥物的耐藥性較弱與試驗(yàn)中腸炎沙門(mén)菌的耐藥結(jié)果一致。本試驗(yàn)在2011—2015年間雞白痢對(duì)復(fù)方新諾明和氟苯尼考的耐藥率為0，腸炎沙門(mén)菌對(duì)黏菌素的耐藥率也為0，這可能與菌株來(lái)源以及抗菌藥物的使用情況有關(guān)。也有相似研究結(jié)果表明，2014年江蘇地區(qū)雞白痢對(duì)氟苯尼考的耐藥率為0，山東地區(qū)腸炎沙門(mén)菌對(duì)多黏菌素敏感[20-21]。

根據(jù)雞白痢和腸炎沙門(mén)菌對(duì)不同抗菌藥物的耐藥率分析，不同時(shí)期不同血清型對(duì)抗菌藥物的耐藥性差異較大。2001—2010年分離的沙門(mén)菌中，雞白痢對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑、四環(huán)素的耐藥率明顯高于腸炎，且多重耐藥情況也較為嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)，這可能與不同血清型的耐受程度有關(guān)[22]。