王麗榮 ， 董永軍 ， 張守平 ， 樊俊洋 ， 李任峰 ， 王振偉 ， 李 玲 ， 王三虎

(河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 ， 河南 新鄉(xiāng) 453003)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis,Hps)屬于巴氏桿菌科嗜血桿菌屬，革蘭陰性多形性桿菌，能引起豬的格氏病，表現(xiàn)漿膜炎、關(guān)節(jié)炎和腦炎的一種高度接觸性呼吸道傳染病。根據(jù)瓊脂擴(kuò)散(Kieletein-rapp-gabriedson,KRG)血清分型方法，Hps分為15種血清型，且不同的血清型其毒力有一定的差異，血清型1、5、10、12、13、14具有高致病力，能夠引起動(dòng)物死亡 ； 血清型2、4、8、15具有中等毒力，能夠引起豬的多發(fā)性漿膜炎，但并不引起死亡 ； 但是血清型3、6、7、9、11不引起明顯的臨床癥狀和病理?yè)p傷[1]。

Hps生物學(xué)特性復(fù)雜，目前國(guó)內(nèi)對(duì)此病的報(bào)道多在病原分離鑒定、血清學(xué)調(diào)查、診斷技術(shù)和疫苗研制等方面，而有關(guān)Hps致病機(jī)理方面的研究很少報(bào)道，其致病機(jī)理和毒力因子至今尚不完全清楚。構(gòu)建穩(wěn)定、可靠的活體感染模型是深入研究這些問(wèn)題的關(guān)鍵。而常規(guī)的飼養(yǎng)豬復(fù)制Glasser’s病例，結(jié)果很難達(dá)到預(yù)期效果，且生產(chǎn)成本高也不易飼喂。國(guó)內(nèi)外學(xué)者曾使用禁食初乳豬[2-3]、自然分娩未食初乳豬[4]作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于其對(duì)試驗(yàn)條件要求和成本均較高，使得其實(shí)際研究有局限性，并不現(xiàn)實(shí)。SPF仔豬即Hps陰性仔豬，也曾被應(yīng)用于Hps的活體感染模型，但目前條件下Hps陰性豬群已經(jīng)很難找到，而且該方法同樣對(duì)技術(shù)要求高，致使成本昂貴，操作難度更大且不可靠，其應(yīng)用研究有局限性[5-6]。因此，很多學(xué)者探索用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠作為替代動(dòng)物模型研究Hps的相關(guān)機(jī)理。

本試驗(yàn)用Hps河南地區(qū)臨床分離野毒株和血清5型標(biāo)準(zhǔn)毒株采用腹腔、灌胃感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物小鼠，通過(guò)觀察發(fā)病或死亡情況和病原再分離，探索河南野毒株對(duì)KM小鼠的致病力，并檢測(cè)Hps在KM小鼠體內(nèi)的分布，比較不同接種途徑對(duì)KM小鼠致病的差異，評(píng)價(jià)Hps河南地區(qū)野毒株和血清5型標(biāo)準(zhǔn)株對(duì)KM小鼠的致病性，以選擇一種經(jīng)濟(jì)、穩(wěn)定及易操作的感染模型，構(gòu)建副豬嗜血桿菌的動(dòng)物感染KM模型，為深入研究Hps的致病機(jī)制、免疫及疾病防控等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 胰蛋白大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白大豆肉湯(TSB)，均購(gòu)自鄭州久是生物技術(shù)有限責(zé)任公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH，購(gòu)自廣東美津生物技術(shù)有限公司；犢牛血清，購(gòu)自北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 菌株、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 副豬嗜血桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株血清5型(BZ)，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所菌種毒種保藏中心；河南野毒株血清5型(YD)由河南科技學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定凍存。

昆明(KM)小鼠，雌性，體重18～20 g，購(gòu)自新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心。

1.3 動(dòng)物感染試驗(yàn) KM小鼠隨機(jī)分為6組，每組7只，其中1～2組為灌胃(ig)感染組，3～4組為腹腔(ip)注射感染組，5～6組為對(duì)照組。

將2個(gè)Hps菌株分別接種含10%犢牛血清、0.1%NAD的TSB培養(yǎng)基，37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)16 h，將培養(yǎng)物配制成1×109CFU劑量，采用灌胃、腹腔注射2種途徑感染小鼠[7-8]，接種劑量為腹腔注射每只0.5 mL，灌胃每只0.5 mL，對(duì)照組滅菌生理鹽水，每只0.5 mL。

不同接種途徑感染小鼠后，觀察小鼠出現(xiàn)的臨床癥狀，記錄小鼠死亡數(shù)及出現(xiàn)的病變和Hps分離培養(yǎng)情況。未死亡小鼠觀察1周剖檢，觀察病變和Hps分離培養(yǎng)，比較不同菌株對(duì)小鼠敏感性的差異。

1.4 臨床和病理觀察 感染后臨床連續(xù)觀察7 d，記錄實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)；對(duì)死亡小鼠及未死亡小鼠攻毒7 d后進(jìn)行剖檢，觀察剖檢病變，并記錄結(jié)果。

1.5 細(xì)菌在感染動(dòng)物體內(nèi)分布的測(cè)定 副豬嗜血桿菌分別感染各組小鼠，感染后死亡及未死亡小鼠于7 d脫臼法迫殺小鼠，無(wú)菌取脾臟、肝臟和肺臟，剪一小塊組織稱重后利用組織研磨器研磨，以無(wú)菌PBS稀釋，取勻漿液均勻涂布于含新生牛血清和NAD的TSA平板上，每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，同時(shí)取胸腔滲出液、心血，無(wú)菌PBS稀釋后涂板培養(yǎng)。

2 結(jié)果

2.1 不同途徑感染小鼠結(jié)果 感染后連續(xù)觀察受試動(dòng)物7 d，發(fā)現(xiàn)Hps腹腔感染小鼠2 h左右出現(xiàn)精神不振，食欲下降，被毛豎立，肌肉震顫，并出現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，見(jiàn)中插彩版圖1；至5 h左右時(shí)，小鼠肌肉震顫漸漸消失，被毛豎立現(xiàn)象消失，依舊扎堆；其中有河南野毒株感染小鼠于43 h、50 h各死亡1只，即感染小鼠2/7死亡，標(biāo)準(zhǔn)菌株感染后44 h死亡1只，即1/7死亡。灌胃感染小鼠4 h左右出現(xiàn)上述癥狀，其中只有河南野毒株組46 h死亡1只。對(duì)照組小鼠正常。結(jié)果見(jiàn)表1、圖2。

表1 感染小鼠死亡情況Table 1 Death of infected mice (只)

圖2 感染小鼠的死亡率Fig.2 Death rate of infected miceA:腹腔感染； B:灌胃感染A:Abdominal infection; B:Intragastric infection

剖檢發(fā)現(xiàn)，1～2組小鼠腹腔感染后，河南野毒株感染死亡的小鼠胸腔有積液，肺臟有出血點(diǎn)，胸腔有黑色血凝塊，腹腔有輕微粘連，且其他臟器無(wú)明顯變化；標(biāo)準(zhǔn)菌株感染組小鼠胸腔積液，肺臟出血，其他無(wú)明顯變化。3～4組小鼠灌胃感染河南野毒株后，死亡小鼠剖檢病變同腹腔感染組，見(jiàn)中插彩版圖3。

2.2 病原分離結(jié)果 無(wú)菌取各組死亡和存活小鼠的胸腔積液、心血、肝臟、脾臟、肺臟，進(jìn)行病原分離，測(cè)定其在組織臟器的分布，結(jié)果顯示，河南野毒株和標(biāo)準(zhǔn)菌株均是腹腔感染組小鼠在心血和胸腔積液中分離到Hps，在肝臟、脾臟、肺臟中未分離到Hps；2菌株灌胃感染組小鼠和對(duì)照組小鼠的胸腔積液、心血、肝臟、脾臟、肺臟均未分離到Hps。見(jiàn)表2。

表2 感染小鼠Hps分離情況Table 2 Isolation of Hps from infected mice

3 討論

副豬嗜血桿菌是豬群上呼吸道的一種常在定居菌，具有明顯的地域特征，能夠突破黏膜屏障導(dǎo)致全身性感染，其毒力是相對(duì)的，有時(shí)取決于豬感染的劑量和個(gè)體的易感性，毒力的差異所引起的保護(hù)性免疫應(yīng)答能力也不相同，但目前Hps已成為豬場(chǎng)保育仔豬死亡的一個(gè)主要因素，其致病機(jī)理和毒力因子尚未完全清楚，Hps人工感染動(dòng)物為闡明該病原菌的致病機(jī)理和尋找毒力因子提供了手段。Hps一般出現(xiàn)在混合感染的病例中，因此學(xué)者們通常認(rèn)為Hps是某些疫病(如PCV2感染、Mhp感染或PRRSV感染)的繼發(fā)病原，其原因是PCV2 或PRRSV能誘導(dǎo)感染動(dòng)物免疫抑制，為細(xì)菌的繼發(fā)感染創(chuàng)造條件，所以普通條件下感染該動(dòng)物，不理想或重復(fù)性很差，用普通豬來(lái)作實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染，成功的機(jī)率很低。本試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠為研究對(duì)象，通過(guò)腹腔、灌胃感染 Hps 血清5型標(biāo)準(zhǔn)菌株和河南野毒株的液體培養(yǎng)物后，觀察了受試動(dòng)物的發(fā)病、死亡和病變情況，并對(duì)感染后各組織器官進(jìn)行了Hps再分離，從而較系統(tǒng)的評(píng)估了 Hps 血清5型河南野毒株和標(biāo)準(zhǔn)毒株對(duì)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物KM小鼠的致病性。從試驗(yàn)的可操作性和經(jīng)濟(jì)方面考慮，在本試驗(yàn)中選用經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明小鼠，腹腔、灌胃感染組均出現(xiàn)死亡，從小鼠肝臟、脾臟、肺臟不容易再次分離到Hps，這與賀云霞等[1]的結(jié)論基本一致，但能從死亡小鼠胸腔滲出液、心血中再分離到Hps，這與李雪松等[9]在小鼠心血中分離到Hps的結(jié)果一致。表明Hps可對(duì)KM小鼠致病，能引起小鼠發(fā)病，說(shuō)明2個(gè)菌株的毒力均較強(qiáng)；受試動(dòng)物死亡率不高及細(xì)菌分離率不高可能與感染劑量有關(guān)，這為KM小鼠作為Hps的感染動(dòng)物模型的候選動(dòng)物奠定了基礎(chǔ)。

從出現(xiàn)的臨床癥狀、小鼠死亡數(shù)、多發(fā)性漿膜炎及 Hps 分離培養(yǎng)，評(píng)估腹腔和灌胃2個(gè)途徑感染的差異，表明腹腔感染優(yōu)于灌胃感染組，且從試驗(yàn)操作可行性方面，腹腔感染更為簡(jiǎn)捷，易操作，這為研究Hps致病機(jī)理等提供了科學(xué)依據(jù)。