秦毅斌 ， 蘇乾蓮 ， 趙 碩 ， 盧冰霞 ， 何 穎 ， 周展宏 ， 袁婷婷 ， 李 斌 ， 段群棚 ， 歐陽(yáng)康 ， 趙 武

(1.廣西獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 ， 廣西南寧530001 ； 2.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院 ， 廣西南寧530005)

豬捷申病(Porcine teschen disease，PTD)，又稱塔爾凡病或腦脊髓炎，是由豬捷申病毒(Porcine teschovirus，PTV)感染引起的一種豬病毒性傳染病。該病首次于1929年在捷克斯洛伐克的捷申地區(qū)發(fā)現(xiàn)，故命名為“捷申病”，隨后傳播至北美、非洲、澳大利亞和日本等國(guó)家，目前已散布于世界各養(yǎng)豬國(guó)家[1]。豬群感染PTV后，主要表現(xiàn)為腹瀉、腦脊髓灰質(zhì)炎[2]、肺炎、心包炎、心肌炎、皮膚損壞等癥狀，母豬還可導(dǎo)致繁殖障礙[3]，感染發(fā)病豬具有較高的病死率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了較大經(jīng)濟(jì)損失。

PTV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)捷申病毒屬(Teschovirus)成員，病毒粒子呈球形，外層包裹衣殼，無(wú)脂蛋白，病毒基因組為單股正鏈RNA，長(zhǎng)約7.2 kb，僅含有1個(gè)完整的編碼1個(gè)多聚蛋白的開放閱讀框(ORF)，該多聚蛋白被蛋白水解酶裂解為非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D和結(jié)構(gòu)蛋白L、VP1、VP2、VP3、VP4[4-5]。PTV至少有11個(gè)血清型[6]，并且還不斷出現(xiàn)新的血清型PTV12[7]、PTV13[8]。研究表明，我國(guó)豬群PTV感染較為普遍。2003年，哈爾濱獸醫(yī)研究所從內(nèi)蒙古某豬場(chǎng)首次分離到PTV Swine/CH/IMH/03株[9]，之后相繼分離到JF613株、jilin/2003株、HB株、Fuyu/2009株和CH/JX/JJ株等多個(gè)毒株并進(jìn)行全基因組測(cè)序分析[10-13]。

為建立更為敏感、特異、快速的PTV檢測(cè)方法，本試驗(yàn)通過GenBank中登錄的PTV的11種血清型基因序列并進(jìn)行比對(duì)分析，以AF231769為模板在保守區(qū)域基因組5′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)合成特異性引物和TaqMan探針，優(yōu)化反應(yīng)條件后，建立了檢測(cè)PTV的一步法RT-qPCR方法，并對(duì)采自廣西各地的豬腹瀉病例糞樣進(jìn)行PTV初步檢測(cè)應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 毒株 PTV、豬丁型冠狀病毒(PDCoV)1468B株[14]、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)750A株[15]、豬細(xì)小病毒(PPV)N株[16]，均為廣西獸醫(yī)研究所病毒研究室分離保存；豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)、A群豬輪狀病毒(PRoVA)、豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬嵴病毒(PKV)及豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)等陽(yáng)性樣品均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 臨床樣品 235份糞樣及腸道組織為2018年3月—2019年4月采自廣西各地發(fā)生豬腹瀉病例的規(guī)模豬場(chǎng)。

1.3 主要儀器和試劑 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀QuantStudioTM5為美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司(ABI)產(chǎn)品；梯度PCR儀為美國(guó)伯樂(BioRad)公司產(chǎn)品；分光光度計(jì)(UV-2450)購(gòu)自日本島冿科技公司。pMD18-T載體、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、一步法RT-qPCR試劑盒[One Step PrimeScriptTMqRT-PCR Kit(Perfect Real Time)]、DNA凝膠回收試劑盒等，均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；病毒DNA/RNA抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量抽提試劑盒、2×TaqPCR Master，均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞為全式金科技公司產(chǎn)品。

1.4 引物及探針的設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank上登錄的11種血清型PTV的基因組序列進(jìn)行序列比對(duì)確定保守區(qū)域，以PTV Talfan株(AF231769)的基因組序列為模板，在保守區(qū)域基因組5′非編碼區(qū)設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物和TaqMan探針，其中引物PTV-F、PTV-R用于擴(kuò)增保守區(qū)域并構(gòu)建重組質(zhì)粒，引物PTV-R-F、PTV-R-R和探針PTV-Probe用于熒光定量反應(yīng)。引物序列見表1，由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 糞便樣品的處理及病毒RNA的提取 糞便樣品及腸道內(nèi)容物按照1∶10比例用PBS(0.01 mol/L, pH 7.2)稀釋制成的懸液，渦旋震蕩充分混勻后，4℃ 10 000 r/min離心10 min后收集上清，立即用于RNA提取或置于-40℃凍存?zhèn)溆?。依?jù)Axygen生物科技有限公司DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行PTV病毒液或者樣品上清核酸的提取。

1.6 pMD18-PTV質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 以PTV分離毒株提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。用引物PTV-F和PTV-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增PTV基因組5′端保守區(qū)域的片段，50 μL反應(yīng)體系：2×TaqPCR Master 25 μL、上下游引物各1 μL(表1)、cDNA模板4 μL，加ddH2O 補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)程序: 95 ℃ 5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，最后12 ℃結(jié)束反應(yīng)低溫保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將目的片段切膠回收純化后連接至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化到DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定及PCR鑒定，陽(yáng)性質(zhì)粒pMD18-PTV送寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物和TaqMan探針序列Table 1 Primers and TaqMan fluorescent probe

1.7 一步法RT-qPCR反應(yīng)條件與體系優(yōu)化 按照試劑盒推薦說明書進(jìn)行PTV一步法RT-qPCR擴(kuò)增反應(yīng)并進(jìn)行優(yōu)化。反應(yīng)體系預(yù)設(shè)為20.0 μL，包括2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F、PTV-R-R各0.4 μL，探針PTV-Probe 1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL補(bǔ)足20.0 μL。反應(yīng)程序: 42 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 45 s，45個(gè)循環(huán)；每個(gè)循環(huán)延伸結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)。將引物和探針在終濃度為0.2～0.8 μmol/L 范圍內(nèi)進(jìn)行濃度優(yōu)化，以確定一步法熒光定量RT-PCR反應(yīng)的最佳引物和探針濃度。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 參照文獻(xiàn)[17]的方法，根據(jù)測(cè)定的質(zhì)粒核酸濃度計(jì)算質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，計(jì)算公式：拷貝/mL =(6.02×1023拷貝/mol)×(質(zhì)粒濃度)/(MWg /mol)。將質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍 倍比系列稀釋成含有4.6×108～4.6×102拷貝/μL的7個(gè)梯度，以此作為模板按照所建立及優(yōu)化的一步法RT-qPCR反應(yīng)進(jìn)行擴(kuò)增。以Ct值為縱坐標(biāo)，以不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的常用對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，推導(dǎo)出標(biāo)準(zhǔn)線性回歸方程，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.9 敏感性試驗(yàn) 分別以4.6×100～4.6×109拷貝/μL 濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-PTV作為模板，對(duì)該方法的敏感性進(jìn)行測(cè)定，以確定所建立的PTV一步法RT-qPCR方法的最低檢測(cè)下限。

1.10 特異性試驗(yàn) 利用所建立的方法，以PTV為陽(yáng)性對(duì)照，同時(shí)檢測(cè)TGEV、PEDV、PDCoV、PRRSV、PKV、PRoVA、CSFV、PPV、PRV、PCV-2等常見的豬病毒，以驗(yàn)證該方法的特異性。

1.11 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn) 取質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD18-PTV的低、中、高(4.6×102、4.6×104、4.6×106拷貝/μL)3個(gè)濃度作為模板，用優(yōu)化后的一步法RT-qPCR進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，根據(jù)各稀釋度的Ct值計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)。將上述3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒保存于-20℃ 冰箱，之后每間隔1周以相同的反應(yīng)條件進(jìn)行檢測(cè)，連續(xù)做3次，計(jì)算各濃度模板Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，來(lái)驗(yàn)證該方法的穩(wěn)定性及組間重復(fù)性。

1.12 臨床樣品的檢測(cè) 對(duì)235份來(lái)自廣西各地不同規(guī)模養(yǎng)豬場(chǎng)腹瀉病例的糞便樣品或腸道內(nèi)容物，應(yīng)用本試驗(yàn)建立的PTV一步法RT-qPCR方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)與先前普通RT-PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，了解廣西豬群PTV的感染狀況。

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件優(yōu)化 通過對(duì)反應(yīng)體系中引物與探針濃度的優(yōu)化，確定了一步法RT-qPCR檢測(cè)PTV的最佳反應(yīng)體系：2×One-Step RT-PCR Buffer Ⅲ 10 μL，TaKaRaExTaqHS(5 U/μL)0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅱ 0.4 μL，引物PTV-R-F(10 μmol/L)、PTV-R-R(10 μmol/L)各0.4 μL，探針PTV-Probe(2 μmol/L)1 μL、ROX Reference Dye Ⅱ(50×)0.4 μL、RNA模板2.0 μL，加ddH2O 5.2 μL補(bǔ)足20.0 μL。優(yōu)化后的反應(yīng)程序如下：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，45個(gè)循環(huán)。

2.2 RT-qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 紫外吸收法測(cè)定重組質(zhì)粒pMD18-PTV質(zhì)量濃度為144 ng/μL，經(jīng)計(jì)算拷貝數(shù)為4.6×1010拷貝/μL。以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)pMD18-PTV重組質(zhì)粒(4.6×108～4.6×102拷貝/μL)為模板進(jìn)行TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)，熒光定量PCR在4.6×108～4.6×102拷貝/μL具有良好的線性關(guān)系(圖1)。根據(jù)檢測(cè)結(jié)果所計(jì)算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2，曲線相關(guān)系數(shù)為0.996，斜率為-3.201，截距為40.527，從而可以得出拷貝數(shù)(X)與Ct值之間的線性關(guān)系表達(dá)式為：Ct=-3.201×logX+40.527。根據(jù)被檢樣本產(chǎn)生的Ct值代入上述表達(dá)式即可計(jì)算出初始拷貝數(shù)。

圖1 質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋RT-qPCR擴(kuò)增曲線Fig.1 Detection results of the recombinant plasmid pMD18-PTV with 10 fold serial dilution by the RT-qPCR assay1～8：重組質(zhì)粒模板濃度分別是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103拷貝/μL和4.6×102拷貝/μL； 9：ddH2O1～8: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103 copies/μL and 4.6×102 copies/μL,respectively； 9:ddH2O

圖2 PTV RT-qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Fig.2 Establishment of the standard curve with recombinant plasmid

2.3 敏感性試驗(yàn) 用建立的PTV一步法RT-qPCR檢測(cè)方法對(duì)4.6×109～4.6×100拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-PTV進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示，該方法的最低檢下限為4.6×101拷貝/μL的質(zhì)粒模板(圖3)。

圖3 RT-qPCR敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The sensitivity test results of RT-qPCR1～10：重組質(zhì)粒模板濃度分別是4.6×109、4.6×108、4.6×107、4.6×106、4.6×105、4.6×104、4.6×103、4.6×102、4.6×101拷貝/μL和4.6×100拷貝/μL； 11：ddH2O1～10: RT-qPCR results of the recombinant plasmid pMD18-PTV concentrations of 4.6×109，4.6×108，4.6×107，4.6×106，4.6×105，4.6×104，4.6×103，4.6×102，4.6×101 copies/μL and 4.6×100 copies/μL,respectively； 11:ddH2O

2.4 特異性試驗(yàn) 利用建立的RT-qPCR檢測(cè)PTV及其他幾種相關(guān)的豬疫病病毒，僅PTV呈陽(yáng)性，出現(xiàn)特異性熒光擴(kuò)增曲線，PDCoV、PEDV、TGEV、PRoVA、PKV、PRV、CSFV、PRRSV、PCV-2、PPV及陰性對(duì)照均為陰性，表明該方法具有良好的特異性(圖4)。

圖4 RT-qPCR特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity test results of RT-qPCR1: PTV陽(yáng)性對(duì)照； 2～11: PEDV，TGEV，PDCoV，PRoVA，PKV，PRV，CSFV，PRRSV，PCV-2，PPV； 12：ddH2O陰性對(duì)照1: PTV positive control; 2～11: PEDV,TGEV,PDCoV,PRoVA,PKV,PRV,CSFV,PRRSV,PCV-2,PPV; 12: ddH2O negative control

2.5 RT-qPCR重復(fù)性分析 將建立的RT-qPCR檢測(cè)方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。分別以4.6×102、4.6×104、4.6×106拷貝/μL的低、中、高濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒pMD18-PTV作為模板，進(jìn)行3次組內(nèi)與組間RT-qPCR反應(yīng)擴(kuò)增。結(jié)果顯示，同一模板濃度的Ct值都很穩(wěn)定，組內(nèi)與組間的3次重復(fù)的變異系數(shù)(CV)均小于4%(表2)，說明具有良好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。

表2 RT-qPCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Repeatability test results of the RT-qPCR

2.6 臨床樣品的檢測(cè) 取2018年3月—2019年4月從廣西不同規(guī)模豬場(chǎng)收集的235份腹瀉病料，對(duì)本試驗(yàn)建立的一步法RT-qPCR方法開展應(yīng)用檢測(cè)。結(jié)果顯示，廣西腹瀉病例樣品中PTV的陽(yáng)性率為13.62%(32/235)，比本實(shí)驗(yàn)室先前建立的普通RT-PCR方法檢出率10.21%(24/235)稍高。普通RT-PCR方法檢測(cè)陽(yáng)性的24份 樣品，RT-qPCR方法檢測(cè)為陽(yáng)性且Ct值較小(15～27)；而用本試驗(yàn)建立的RT-qPCR方法從普通RT-PCR方法檢測(cè)陰性的211份樣品篩查到8份為PTV陽(yáng)性，但是它們的Ct值較大(30～35)。

3 討論

PTV最早發(fā)現(xiàn)于捷克斯洛伐克，1930—1950年間，歐洲有數(shù)千例PTV-1毒株引起的豬腦脊髓灰質(zhì)炎暴發(fā)，使養(yǎng)豬業(yè)蒙受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨后其毒力逐漸改變，表現(xiàn)為腦脊髓炎的病例明顯減少，高致病性的毒株被弱毒株所取代[18]。目前，PTV有至少13個(gè)血清型，通常大多數(shù)毒株是引起無(wú)明顯臨床癥狀的隱性感染，但一些毒株感染可引起諸如腦脊髓炎、肺炎、腸炎及繁殖障礙等一系列相關(guān)病癥的疾病。

健康豬群中PTV亞臨床感染較為普遍[19]，可從無(wú)明顯臨床癥狀豬只的糞便乃至內(nèi)臟器官中檢測(cè)到或者分離到該病毒，雖然病毒的毒力不強(qiáng)，但往往成為不被重視的傳染源，造成的危害亦不容忽視。

近些年來(lái)，對(duì)PEDV、TGEV和PDCoV的研究報(bào)道相對(duì)較多，而對(duì)PTV在引起腹瀉中扮演什么樣的角色仍然知之甚少。迄今已有多個(gè)血清型的PTV毒株相繼從發(fā)病豬的腸道或者內(nèi)臟器官中分離出來(lái)，動(dòng)物試驗(yàn)亦證實(shí)這些PTV毒株可以引起豬只出現(xiàn)包括腹瀉在內(nèi)的癥狀及相關(guān)的病理變化[10,12,20]。從攻毒豬的臨床表現(xiàn)及腸道病理變化來(lái)說，PTV與PEDV、TGEV、PDCoV引起的臨床癥狀表現(xiàn)極為相似，僅靠眼觀根本無(wú)法確定究竟是哪種病毒感染引起的腹瀉，因此需借助實(shí)驗(yàn)室診斷來(lái)確定病原。針對(duì)PTV的檢測(cè)方法包括傳統(tǒng)的病毒分離、間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化(IHC)等方法。病毒分離可靠，但耗時(shí)費(fèi)力；免疫學(xué)試驗(yàn)雖然敏感，但容易出現(xiàn)交叉反應(yīng)。分子生物學(xué)檢測(cè)方法，尤其是熒光定量PCR方法，具有特異性強(qiáng)、耗時(shí)短等優(yōu)點(diǎn)。

熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)應(yīng)用生物技術(shù)公司推出。實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在熒光PCR基礎(chǔ)上的技術(shù)革新，其通過熒光信號(hào)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，每一次PCR循環(huán)結(jié)束時(shí)收集一次熒光信號(hào)值，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，精準(zhǔn)地確定實(shí)時(shí)熒光定量PCR的Ct值，進(jìn)而依據(jù)Ct值確定起始DNA模板拷貝數(shù)，真正做到DNA定量[21]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR根據(jù)其原理及方法可以分為TaqMan探針、SYBR GreenⅠ熒光染料、分子信標(biāo)和雜交探針等[22-23]。其中TaqMan探針法實(shí)時(shí)熒光定量PCR是高度特異的定量PCR技術(shù)，采用了引物和探針的“雙重保險(xiǎn)”，探針與2條特異性引物擴(kuò)增出來(lái)的目標(biāo)DNA互補(bǔ)結(jié)合，并利用Taq酶的5′→3′外切核酸酶活性，探針被切斷后熒光報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)弱就代表了模板的數(shù)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR具有更快速、便捷、特異、敏感以及定量檢測(cè)的特性，已廣泛用于人和動(dòng)物各種疫病的臨床檢測(cè)。

本試驗(yàn)建立的檢測(cè)PTV的RT-qPCR方法，具有良好的特異性，與常見的豬腸道致病病毒均無(wú)交叉反應(yīng)。應(yīng)用所建立的方法對(duì)采自廣西各地的235份腹瀉樣品進(jìn)行檢測(cè)，PTV的陽(yáng)性檢出率為13.62%，表明廣西部分豬場(chǎng)普遍存在PTV感染，應(yīng)重視并加強(qiáng)對(duì)該病監(jiān)測(cè)及綜合防控；同時(shí)該方法比本實(shí)驗(yàn)室先前建立的普通RT-PCR方法10.21%的檢出率高，說明該方法比普通PCR的敏感度更高。總之，本試驗(yàn)所建立的RT-qPCR方法為PTV的檢測(cè)和病毒研究分析提供了一種快速、敏感和特異的技術(shù)手段，為進(jìn)一步做好廣西PTD的檢測(cè)監(jiān)測(cè)、預(yù)警及防控提供了有力支撐。