徐 璐 ， 張乾義 ， 夏應(yīng)菊 ， 任雪健 ， 李 翠 ， 鄒興啟 ， 徐 嫄 ， 王 兆 ， 趙啟祖 ， 王 琴

(1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 國家/OIE豬瘟參考實(shí)驗(yàn)室 ， 北京 海淀 100081 ； 2. 洛陽萊普生信息科技有限公司 ， 河南 洛陽 471000)

豬瘟在我國為優(yōu)先防治的重大動(dòng)物疫病之一。雖然在2017年3月，該病已經(jīng)正式退出國家的強(qiáng)制免疫計(jì)劃[1]，但豬瘟疫苗仍然是我國免疫覆蓋率最高的豬用疫苗之一。近年來，市場上不斷有豬瘟抗體檢測試劑盒面世，但仍以傳統(tǒng)的間接或阻斷ELISA方法為主[2]，試劑盒的操作便捷性和信號(hào)靈敏度等方面并未有明顯的提高。對于各大中型養(yǎng)豬場及各級動(dòng)物疫病控制中心來說，豬瘟抗體檢測的樣本量大，操作復(fù)雜，存在檢測時(shí)間長，勞動(dòng)強(qiáng)度大等問題。另外，傳統(tǒng)ELISA試劑盒多采用TMB底物，信號(hào)的線性范圍窄，無法準(zhǔn)確區(qū)分不同抗體效價(jià)的血清，大大影響了試劑盒的檢測效果。

本課題組采用豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體作為競爭抗體，以化學(xué)發(fā)光底物作為顯色體系，開發(fā)了豬瘟病毒化學(xué)發(fā)光競爭ELISA抗體檢測試劑盒(簡稱：發(fā)光試劑盒)。為了評價(jià)該試劑盒的臨床應(yīng)用效果，采用本試劑盒和進(jìn)口試劑盒同時(shí)在6個(gè)地區(qū)進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，共檢驗(yàn)血清樣本2 200份。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試劑盒檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，對田間采集的391份血清樣本采用豬瘟抗體檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)方法-熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(Fluorescent antibody virus neutralisation test，F(xiàn)AVN)進(jìn)行了定性檢測，評價(jià)本試劑盒與FAVN的符合率。另外，采用本試劑盒對5頭免疫豬的抗體消長規(guī)律進(jìn)行了監(jiān)測，進(jìn)一步評價(jià)本試劑盒對免疫血清的檢測效果。

1 材料與方法

1.1 材料 PK15傳代細(xì)胞系、豬瘟病毒Thiverval 株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存并提供；豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備并提供；FITC羊抗鼠二抗，購自Sigma公司；發(fā)光試劑盒，批號(hào)為E160602，由洛陽萊普生信息科技有限公司制備；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒(簡稱：進(jìn)口試劑盒)，批號(hào)為G261，購自IDEXX公司。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 3月齡健康仔豬，未免疫豬瘟疫苗，無豬瘟母源抗體，購自保定山區(qū)散養(yǎng)戶。

1.3 血清樣本 臨床血清樣本2 200份，分別由6家地市級動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供，采自山東、河南、山西省和陜西??；田間采集的豬瘟疫苗免疫和非免疫血清，共計(jì)391份。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 臨床血清樣本的檢測 將6家實(shí)驗(yàn)單位提供的2 200份臨床血清樣本，分別用發(fā)光試劑盒和進(jìn)口試劑盒進(jìn)行檢測，檢測步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，計(jì)算2種試劑盒的一致性。

1.4.2 與金標(biāo)準(zhǔn)方法的比較 將田間采集的391份血清，分別采用發(fā)光試劑盒和FAVN方法對血清樣本進(jìn)行檢測，計(jì)算發(fā)光試劑盒與FAVN之間的一致性。FAVN試驗(yàn)具體操作步驟參見《陸生動(dòng)物診斷試劑和疫苗手冊》[3]。

1.4.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 選擇SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)算Kappa值，進(jìn)行一致性分析，對應(yīng)Kappa 值為：0.0～0.20極低的一致性、0.21～0.40一般的一致性、0.41～0.60 中等的一致性、0.61～0.80 高度的一致性和0.81～1幾乎完全一致。

1.4.4 對免疫抗體消長的檢測 將試驗(yàn)豬分為2組。第1組5頭豬，為免疫組，每頭豬免疫1頭份豬瘟活疫苗(傳代細(xì)胞源)，批號(hào)為0907，廣東永順生物制藥有限公司產(chǎn)品；第2組2頭豬，為對照組，每頭豬接種1 mL生理鹽水。分別于免疫之后的第1、3、6、9、12、15、18、21、28、32、39、50、56、63、70、80、112天和第177天采集血清，用發(fā)光試劑盒進(jìn)行檢測，觀察免疫抗體消長趨勢。

2 結(jié)果

2.1 對臨床血清樣本的檢測 在臨床檢測的2 200份豬血清樣本中，發(fā)光試劑盒檢測出1 452份陽性，748份陰性；進(jìn)口試劑盒檢測出1 420份陽性，769份陰性，結(jié)果見表1。采用SPSS軟件，計(jì)算2種試劑盒的Kappa值為0.78，說明發(fā)光試劑盒與進(jìn)口商品化試劑盒具有高度一致性。

表1 發(fā)光試劑盒與進(jìn)口試劑盒的一致性Table 1 The coincidence of CLIA kit with IDEXX kit

2.2 與金標(biāo)準(zhǔn)方法的比較 在391份血清中，包括豬瘟抗體陽性血清191份，陰性血清200份。其中發(fā)光試劑盒檢測出191份陽性，其中182份與FAVN結(jié)果一致；檢測出200份陰性，有191份與FAVN結(jié)果一致，結(jié)果見表2。采用SPSS軟件，計(jì)算2種方法的Kappa值為0.908，二者結(jié)果幾乎完全一致，說明該試劑盒的檢測結(jié)果更接近于金標(biāo)準(zhǔn)方法。

表2 發(fā)光試劑盒與FAVN的一致性Table 2 The coincidence of CLIA kit with FAVN

2.3 免疫血清抗體消長規(guī)律 從檢測結(jié)果可以看出，免疫后15 d，4/5的免疫豬抗體轉(zhuǎn)陽，免疫后18 d， 全部免疫豬的抗體轉(zhuǎn)陽。而未免疫對照組直至試驗(yàn)結(jié)束均為抗體陰性。從中插彩版圖1中可以看出，免疫后177 d，5頭免疫豬的豬瘟抗體仍為陽性，且不同個(gè)體的抗體水平存在較大差異。

3 討論

ELISA方法檢測到的抗體均為結(jié)合抗體，雖然這些抗體能夠與抗原發(fā)生特異性結(jié)合，但不一定會(huì)使病原失去感染性。而中和抗體則不同，與病原結(jié)合后，能夠使病原喪失感染宿主細(xì)胞的能力。有研究表明[4]，疫苗免疫后的陽性血清對不同豬瘟毒株的中和抗體效價(jià)不同。在豬瘟疫苗免疫初期，細(xì)胞免疫對攻毒保護(hù)起了非常重要的作用。而在免疫的中后期，體液免疫在疫苗保護(hù)中起了決定作用。因此中和抗體能夠更加準(zhǔn)確的反應(yīng)機(jī)體的免疫狀況，更適用于免疫效果評價(jià)。有研究者對結(jié)合抗體和中和抗體效價(jià)進(jìn)行了比較，證明二者的相關(guān)性根據(jù)方法不同而有所差異[5-6]。

豬瘟疫苗免疫后，能夠引起體液免疫反應(yīng)，使機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體。豬瘟抗體檢測包括2類，一類為檢測結(jié)合抗體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、正相間接血凝試驗(yàn)(IHA)、抗體膠體金免疫快速檢測技術(shù)[7]、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)以及免疫芯片技術(shù)等；另一類為檢測中和抗體的病毒中和試驗(yàn)。病毒中和試驗(yàn)是檢測豬瘟抗體的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法的操作復(fù)雜，檢測時(shí)間長，檢測成本高，影響因素多，無法推廣使用。發(fā)光試劑盒通過對單克隆抗體的篩選，選擇了1株具有適宜親和力、且具有中和活性的單克隆抗體作為本試劑盒的競爭抗體，減少了檢測步驟，大大縮短檢測時(shí)間至1 h以內(nèi)。通過對2 200份臨床血清的檢測，證明發(fā)光試劑盒與進(jìn)口商品化試劑盒的檢測結(jié)果具有高度的一致性，說明本試劑盒的敏感性、特異性等關(guān)鍵指標(biāo)均不低于進(jìn)口產(chǎn)品。而與金標(biāo)準(zhǔn)方法(FAVN)的比較結(jié)果說明本試劑盒的結(jié)果與中和抗體效價(jià)更為接近。

采用發(fā)光試劑盒對免疫后豬血清抗體的消長情況進(jìn)行檢測，證明在免疫后18 d，所有的免疫血清全部轉(zhuǎn)為陽性。而在本課題組之前的研究中，免疫豬血清在免疫后15～28 d可全部轉(zhuǎn)為陽性，與本研究的結(jié)果基本一致[8-9]，說明本試劑盒的靈敏度不低于現(xiàn)有商品化ELISA試劑盒產(chǎn)品。另外，從結(jié)果中可以看出，不同的個(gè)體免疫后抗體增長的時(shí)間和增長幅度有很大差異，說明個(gè)體差異對免疫效果存在很大影響。